熊小毛，劉俊超，繆禮鴻，劉蒲臨（.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司,湖北松滋43400；.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢43003）

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兼香型白酒不同輪次及操作的酒醅細菌種類與數(shù)量分析

熊小毛1，劉俊超2，繆禮鴻2，劉蒲臨2
（1.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司,湖北松滋434200；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

摘要：采用稀釋平板分離法和細菌16S rDNA序列同源比對方法，對白云邊機械化班組和傳統(tǒng)班組第1輪至第7輪入池前堆積料及第3輪至第7輪出池酒醅中細菌的數(shù)量和種類進行了分析比較。結(jié)果表明，機械化班組和傳統(tǒng)班組的前5輪入池堆積料中細菌活菌數(shù)均隨著發(fā)酵輪次的增加而不斷減少。從機械化和傳統(tǒng)工藝組的酒醅中共分離獲得36株細菌，將這些細菌鑒定為1個屬4個種，分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。不同輪次的白云邊機械化班組和傳統(tǒng)班組酒醅中的主要細菌均為B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，表明這2種芽孢桿菌是白云邊酒醅中的優(yōu)勢細菌。從2種操作工藝的酒醅中分離的細菌群落結(jié)構(gòu)無明顯差異。

關(guān)鍵詞：兼香型白酒；生產(chǎn)工藝；酒醅；細菌群落；白酒

細菌是中國傳統(tǒng)大曲酒生產(chǎn)過程中的重要微生物，在大曲、高溫堆積料、發(fā)酵酒醅以及窖泥中均有多種細菌存在并發(fā)揮作用。有研究表明這些參與白酒釀造的細菌中以芽孢桿菌類細菌為主[1-2]。這些芽孢桿菌能夠產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等多種酶類，同時也被認為是白酒醬香風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)鍵[3-5]。

本研究對兼香型白云邊大曲酒機械化釀酒車間和傳統(tǒng)釀酒車間不同輪次的入池前堆積料以及出池酒醅中的細菌種類和數(shù)量進行了對比分析，旨在解析機械化與傳統(tǒng)操作工藝對不同輪次白云邊酒醅細菌種類及數(shù)量的影響，為傳統(tǒng)白酒的生產(chǎn)調(diào)控及機械化釀酒工藝的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品采集

分別采集湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司機械化攤晾操作釀酒車間和傳統(tǒng)操作釀酒車間的第1輪次至第7輪次的入窖池前堆積料和第3輪次至第7輪次出窖池酒醅。入池前分表層和里層（距表層20 cm）取樣，每層選取同一水平面的4個位置點各100 g，混勻；出池分上、中、下層取樣，每層選取同一水平面的5個位置點各100 g，混勻。

1.1.2培養(yǎng)基

細菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基[6]；MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖5 g，吐溫80取1 g，磷酸氫二鉀2 g，醋酸鈉5 g，檸檬酸二胺2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1000 mL，pH6.5～6.8。配制固體平板時添加2 %瓊脂粉。

1.1.3主要試劑

菌株DNA提取、16S rDNA片段擴增所用的酶、Marker、dNTPs、Buffer等購于生工生物上海股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1細菌分離方法

稱取10 g酒醅或發(fā)酵堆積料，置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，170 r/min搖床5 min后，采用稀釋平板法分別涂布于牛肉膏蛋白胨平板及MRS平板上，分別置于30℃和37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，計數(shù)，取單菌落經(jīng)劃線分離純化（其中的單菌落均為每一輪次的優(yōu)勢細菌菌落）、鏡檢，編號后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細菌活菌數(shù)測定方法

采用稀釋平板測數(shù)法[6]。分別將采集到的白云邊酒醅及發(fā)酵堆積料用無菌水浸出，按照不同梯度稀釋，取不同稀釋度的樣液各100 μL分別涂布于牛肉膏-蛋白胨平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，2 d后記數(shù)平板上細菌菌落數(shù)。

1.2.3細菌DNA的提取

將分離到的細菌菌株在牛肉膏蛋白胨平板上活化并多次劃線純化后接種到LB液體培養(yǎng)基中于37℃、170 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)14 h，用細菌基因組抽提試劑盒提取基因組DNA，檢測后置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 16S rDNA的PCR擴增和測序

以細菌基因組DNA為模板作PCR擴增16S rDNA，擴增引物采用通用引物16S-27F（5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'）和16S-1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反應(yīng)體系采用50 μL反應(yīng)體系，其中引物27F/1492R各1 μL，Premix Taq（2×）25 μL，模板DNA 1 μL，無菌雙蒸水22 μL。PCR循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃50 s，54℃50 s，72℃1 min 30 s；循環(huán)30次；72℃延伸10 min。

1.2.5構(gòu)建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

擴增的PCR產(chǎn)物送金唯智生物科技（北京）有限公司測序，測序長度1500 bp左右，測序結(jié)果采用DNAstar軟件序列圖譜人工校對拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索比對，比較測試菌株和已知細菌菌株之間的親緣關(guān)系及系統(tǒng)地位。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，選取測試菌株關(guān)系較近的模式菌株的16S rDNA序列，用MEGA5.0軟件采取鄰接法Neighborjoining，進行1000次Bootstrap計算后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

注：1為JRB3-2；2為JRB4-1；3為JRB4-2；4為JRB3-3；5為JRB2-1。圖1 代表性細菌16S rDNA的PCR擴增凝膠電泳圖

2　結(jié)果與分析

2.1白云邊酒醅細菌菌株的分離鑒定

細菌16S rDNA擴增結(jié)果。利用細菌基因組抽提試劑盒提取的DNA為模板，進行PCR擴增得到的結(jié)果見圖1。1～5號細菌擴增條帶大小均在1500 bp左右，可以判斷已經(jīng)成功擴增出該目標菌株的16S rDNA片段。

2.2不同操作工藝釀酒車間細菌分類鑒定結(jié)果

2.2.1機械化釀酒車間分離細菌的系統(tǒng)分類

從機械化釀酒車間第1輪次至第7輪次入池前堆積料和第3輪次至第7輪次出池酒醅中共分離出20株細菌，根據(jù)16S rDNA序列同源性構(gòu)建的細菌系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。這20株細菌與GenBank中芽孢桿菌屬的3種模式菌種（B.amyloliquefaciens、B.licheniformis和B.methylotrophicus）的序列相似度均≥99 %，其中13株為B.amyloliquefaciens，占所分離細菌總數(shù)的65.0 %；6株為B.licheniformis，占細菌總數(shù)的30.0 %；1株為B.methylotrophicus,占細菌總數(shù)的5.0 %。表明B.amyloliquefaciens和B.licheniformis為機械化釀酒車間酒醅中的優(yōu)勢細菌。

2.2.2傳統(tǒng)釀酒車間分離細菌的系統(tǒng)分類

圖2 20株機械化釀酒車間細菌基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 16株傳統(tǒng)釀酒車間細菌基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

從傳統(tǒng)釀酒車間第1輪次至第7輪次入池前堆積料和第3輪次至第7輪次出池酒醅中共分離出16株細菌，根據(jù)細菌16S rDNA序列的同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

由圖3可知，這16株細菌與GenBank中的芽孢桿菌屬的3種模式菌種（B.amyloliquefaciens、B.subtilis和B. licheniformis）的序列相似性均≥99 %，其中B.amyloliquefaciens有9株，B.licheniformis有6株，B. subtilis有1株，分別占所分離細菌總數(shù)的56.3 %、37.5 %和6.3 %。表明B.amyloliquefaciens和B. licheniformis為傳統(tǒng)釀酒車間的優(yōu)勢細菌，這與機械化釀酒車間分離到的細菌種類及所占比例相似。

2.3機械化釀酒工藝和傳統(tǒng)釀酒工藝對細菌數(shù)量的影響

2.3.1機械化操作班組和傳統(tǒng)操作班組入池前堆積料中細菌活菌數(shù)的比較

第1輪次至第7輪次機械化組和傳統(tǒng)組入池前表層堆積料中細菌活菌數(shù)的比較結(jié)果見圖4。由圖4可知，第1輪次至第3輪次和第5輪次機械化組入池前堆積料中細菌活菌數(shù)多于傳統(tǒng)組中細菌活菌數(shù)，第4輪次、第6輪次、第7輪次則傳統(tǒng)組中細菌活菌數(shù)多于機械化組中細菌活菌數(shù)。

第1輪次至第7輪次機械化組和傳統(tǒng)組入池前里層堆積料中細菌活菌數(shù)的比較結(jié)果見圖5。由圖5可知，第1輪次、第2輪次機械化組中細菌活菌數(shù)多于傳統(tǒng)組中細菌活菌數(shù)，第3輪次至第7輪次則表現(xiàn)為傳統(tǒng)組中細菌活菌數(shù)多于機械化組中細菌活菌數(shù)。

圖4 機械化組和傳統(tǒng)組入池前表層堆積料中細菌活菌數(shù)的比較

圖5 機械化組和傳統(tǒng)組入池前里層堆積料中細菌活菌數(shù)的比較

2.3.2機械化操作班組和傳統(tǒng)操作班組出池酒醅中細菌活菌數(shù)的比較

第3輪次至第7輪次機械化組和傳統(tǒng)組出池上層酒醅中細菌活菌數(shù)的比較結(jié)果見圖6。由圖6可知，第3輪次、第4輪次機械化組細菌活菌數(shù)多于傳統(tǒng)組的細菌活菌數(shù)，第6輪次、第7輪次則表現(xiàn)為傳統(tǒng)組細菌活菌數(shù)多于機械組的細菌活菌數(shù)，第5輪次機械組和傳統(tǒng)組細菌活菌數(shù)相差不多。

第3輪次至第7輪次機械化組和傳統(tǒng)組出池中層和下層酒醅中細菌活菌數(shù)的比較結(jié)果分別見圖7和圖8。由圖7和圖8可知，第3輪次、第4輪次機械化組中層和下層酒醅的細菌活菌數(shù)均多于傳統(tǒng)組，第6輪次、第7輪次則表現(xiàn)出傳統(tǒng)組細菌活菌數(shù)均多于機械組，第5輪次機械組和傳統(tǒng)組的細菌數(shù)相差不多。

2.4不同輪次及操作工藝入池和出池酒醅細菌種類的比較

圖6 機械化組和傳統(tǒng)組出池上層酒醅中細菌活菌數(shù)的比較

圖7 機械化組和傳統(tǒng)組出池中層酒醅中細菌活菌數(shù)比較

圖8 機械化組和傳統(tǒng)組出池下層酒醅中細菌活菌數(shù)比較

第1輪次至第7輪次機械組和傳統(tǒng)組入池前堆積料中分離的細菌種類及分布比較結(jié)果見表1。由表1可知，機械組和傳統(tǒng)組第1輪次至第7輪次入池前堆積料中占優(yōu)勢的細菌主要是B.amyloliquefaciens和B.licheniformis。從每輪次入池前堆積料中均只分離到2種芽孢桿菌。除第1輪次外，幾乎在2個操作班組的每個輪次的入池堆積料中均能分離到B.amyloliquefaciens，而B.subtilis僅在第4輪次傳統(tǒng)組的入池堆積料中出現(xiàn)過1次。

第3輪次至第7輪次機械組和傳統(tǒng)組出窖池酒醅中細菌種類及分布比較結(jié)果見表2。由表2可知，2種工藝組的出池酒醅中的細菌主要也是B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，與入池料中的細菌種類相同，表明其具有相同的來源，并且這2種芽孢桿菌具有較強的耐受能力，是酒醅中的優(yōu)勢細菌。

3　討論

本研究從白云邊機械化和傳統(tǒng)釀酒車間不同輪次的酒醅中共分離獲得36株細菌，經(jīng)細菌系統(tǒng)分類鑒定它們均屬于芽孢桿菌屬。從細菌種類上看，僅出現(xiàn)4種芽孢桿菌，比預(yù)期的細菌種類要少，可能是由于所分離到的4種細菌在數(shù)量上大大超過可能存在的其他種類細菌，導(dǎo)致占少數(shù)的細菌在分離過程中被稀釋掉而未能出現(xiàn)在平板上。為了獲得更多種類的細菌，選擇適當(dāng)?shù)母患囵B(yǎng)方法有待進一步研究。

表1 第1輪次—第7輪次機械化組和傳統(tǒng)組入池前堆積料中細菌種類比較

表2 第3輪次—第7輪次機械化組和傳統(tǒng)組出池酒醅中細菌種類比較

從總體上看，無論是機械化組還是傳統(tǒng)組，前5輪次入池堆積料中的細菌活菌數(shù)均隨著發(fā)酵輪次的增加而不斷減少，第6輪次至第7輪次的細菌活菌數(shù)又有所上升。不同輪次的出池酒醅的細菌活菌數(shù)均比其入池酒醅細菌數(shù)明顯減少，其中第5輪次和第6輪次出池酒醅中的細菌活菌數(shù)最低，相反，這2個輪次酒醅的出酒率和酵母菌活菌數(shù)均最高（待發(fā)表），表明酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量與白酒產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。不同輪次的白云邊機械化組和傳統(tǒng)組的入池和出池酒醅中的主要細菌均為B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，表明這2種芽孢桿菌是白云邊酒醅中的優(yōu)勢細菌。2種操作工藝的白云邊酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)沒有明顯差異。

白云邊大曲酒采用高溫制曲、高溫堆積、多輪發(fā)酵工藝。前期研究表明，白云邊酒高溫堆積過程中的細菌主要為B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.velezensis、B. licheniformis等芽孢桿菌屬[7]，與白云邊高溫大曲中的優(yōu)勢細菌種類相同[8]，表明白云邊酒醅中的芽孢桿菌主要來源于其高溫大曲。B.amyloliquefaciens和B.licheniformis能夠在白云邊高溫堆積料和出池酒醅中均占優(yōu)勢，可能與B.amyloliquefaciens和B.licheniformis具有較好的耐乙醇和耐高溫能力有關(guān)[9-11]。

有研究報道稱B.amyloliquefaciens和B.licheniformis能夠產(chǎn)生四甲基吡嗪、2-戊基呋喃等多種香味物質(zhì)成分，與醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成相關(guān)[12-16]。通過高溫制曲、高溫堆積發(fā)酵工藝富集占優(yōu)勢的芽孢桿菌，釀造出具有醬香風(fēng)味的中國傳統(tǒng)白酒，它們之間形成了必然的因果關(guān)系。白云邊酒為濃醬兼香型，其醬香風(fēng)味物質(zhì)的形成可能與這2種在酒醅中占優(yōu)勢的芽孢桿菌相關(guān)。

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Analysis of the Species and Quantities of Bacteria in Fermented Grains of Jianxiang Baijiu in Different Production Round

XIONG Xiaomao1, LIU Junchao2, MIAO Lihong2and LIU Pulin2
(1. Hubei Baiyunbian Liquor Co. Ltd., Songzi, Hubei 434200; 2.School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan, Hubei 430023, China）

Abstract:In this study, the species and quantities of bacteria in fermented grains of Baiyunbian Liquor before pit-entry from the 1st production round to the 7th production round/ after pit-exit from the 3rd production round to the 7th production round (both in mechanized operation workshop and in traditional operation workshop) were analyzed and compared using dilution plate count and 16S rDNA sequencing and homologous analysis. The results showed that, the quantities of live bacteria in fermented grains in the first five production rounds kept decreasing with the increase of fermentation round in both mechanized operation workshop and traditional operation workshop. 36 bacteria strains in total were isolated from fermented grains in the two workshops, and those bacteria strains were classified into four species including Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis and Bacillus methylotrophicus. B.amyloliquefaciens and B.licheniformis were the dominant bacteria species in both workshops, suggesting the two strains were the predominant bacteria in Baiyunbian fermented grains. Besides, there was no significant difference in bacteria colony structure from both workshops.

Key words:Jianxiang Baijiu; production techniques; fermented grains; bacteria colony; Baijiu

通訊作者：繆禮鴻（1965-），男，博士，教授，E-mail：miaowhpu@126.com。

作者簡介：熊小毛（1960-），男，湖北天門人，教授級高級工程師，從事科學(xué)研究、技術(shù)開發(fā)、質(zhì)量管理工作30余年，取得多項科研成果，第一批享受國務(wù)院津貼者，全國勞動模范、國家白酒協(xié)會專家委員會專家，現(xiàn)任湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司常務(wù)副總經(jīng)理、總工程師。

收稿日期：2015-12-24

基金項目：湖北省重大科技創(chuàng)新計劃項目資助（2013ABA008）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015479

中圖分類號：TS262.3；TS261.4；TS261.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0030-05

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1335.003.html。