張鳳杰，王德良，薛　潔，閆寅卓（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

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黃酒釀造過程中優(yōu)勢細菌產(chǎn)生物胺的檢測與評價

張鳳杰，王德良，薛潔，閆寅卓
（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

摘要：采用顯色培養(yǎng)基法、脫羧酶序列特異PCR技術(shù)和HPLC分析脫羧酶液體培養(yǎng)基生物胺含量變化3種方法檢測和評價來自黃酒釀造過程的41株細菌產(chǎn)生物胺的情況。研究表明，3種方法檢測結(jié)果大致相同，互補使用能夠準確分析細菌產(chǎn)生物胺的情況；41株細菌中，53.7 %以上都能產(chǎn)酪胺，31.7 %以上產(chǎn)腐胺，24.3 %以上產(chǎn)組胺；14株短乳桿菌均攜帶酪氨酸脫羧酶基因，其中11株菌的酪胺產(chǎn)量超過50.00 mg/L，且多數(shù)菌能代謝產(chǎn)生多種生物胺，因此推斷其對黃酒中生物胺含量影響最大；細菌代謝是否產(chǎn)生物胺及產(chǎn)生物胺的能力無種屬特異性，但有菌株特異性。

關(guān)鍵詞：黃酒；細菌；生物胺；顯色培養(yǎng)基；PCR；HPLC

黃酒釀造采用開放式的工藝形式，釀造過程中微生物種類和數(shù)量繁多，細菌群落結(jié)構(gòu)復雜，參與發(fā)酵過程的細菌主要有乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌、糖多孢菌、葡萄球菌等，還有一些不可培養(yǎng)的細菌[1-2]。微生物的多種代謝產(chǎn)物對于黃酒風味和品質(zhì)有重要影響[3]，然而，這也會使黃酒中含有一些微量有害物質(zhì)，如氨基甲酸乙酯（ethylcarbamate，EC）[4-5]、生物胺（Biogenic amines，BAs）[6]等。

生物胺是一類具有生物活性的含氮低分子量有機化合物的總稱，普遍存在于多種食品中，其中毒性最大的是組胺，其次是酪胺[7]。生物胺生成需要3個條件：（1）生物胺前體物質(zhì)游離氨基酸；（2）微生物及適合微生物生存的條件；（3）發(fā)生脫羧反應的條件。腐胺是黃酒中含量最大的胺，腐胺、酪胺和組胺的平均含量分別為37.201 mg/L、 25.294 mg/L和6.173 mg/L[8]。黃酒中生物胺主要來自釀造過程，豐富的氨基酸和乳酸菌的存在是生物胺增加的主要原因[9-10]，釀造過程中的微生物代謝產(chǎn)生脫羧酶，該酶催化相應的游離氨基酸脫去羧基生成生物胺。氨基酸作為產(chǎn)品價值的一部分而大量存在于黃酒中，所以控制黃酒中生物胺含量的關(guān)鍵在于控制釀造過程中能夠產(chǎn)生生物胺的微生物種類和數(shù)量。

因此，本研究采用顯色培養(yǎng)基法、脫羧酶序列特異PCR檢測法和HPLC分析生物胺含量變化法這3種方法，篩查黃酒釀造過程中優(yōu)勢細菌的產(chǎn)胺情況，重點評價其產(chǎn)組胺、酪胺和腐胺的能力。探究產(chǎn)生物胺菌株有無共性差異，為進一步控制黃酒中生物胺含量提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

菌株：實驗室保藏的41株細菌，分離源均為黃酒生產(chǎn)過程。

生物胺檢測培養(yǎng)基[11]：MRS培養(yǎng)基中添加5'-磷酸吡多醛0.05 g/L，溴甲酚紫0.06 g/L，瓊脂20 %，分別添加L-組氨酸1.0 g/L、L-酪氨酸0.4 g/L制成組胺檢測平板、酪胺檢測平板和腐胺檢測平板。

生物胺檢測液體培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加5'-磷酸吡多醛0.05 g/L，溴甲酚紫0.06 g/L，添加L-組氨酸1.0 g/L、L-酪氨酸0.4 g/L、L-鳥氨酸1.0 g/L。

化學試劑：8種單體生物胺標樣（色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺），1,7-二氨基庚烷（內(nèi)標），丹磺酰氯(衍生劑)，均為Sigma公司產(chǎn)品；三氯甲烷，正丁醇，丙酮，甲醇，均為色譜純；乙醚，谷氨酸鈉，乙酸鈉，碳酸氫鈉，氯化鈉，鹽酸等；5'-磷酸吡哆醛（輔酶），溶菌酶，北京陸橋技術(shù)有限責任公司；DP302細菌基因組提取試劑盒，2×Tap mastermix，天根生化；瓊脂糖，Biowest Agarose；EB，Sigma等。

儀器設備：高效液相色譜儀，Perkin Elmer Series 200，紫外檢測器；安捷倫C18色譜柱（5μm，150 mm×4.6 mm）；氮吹儀；溫度梯度PCR儀，美國ABI公司；凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；電泳儀，北京六一儀器廠；MiniSpin個人型高速離心機，德國Eppendorf；立式電壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海恒科儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司等。

1.2實驗方法

1.2.1顯色培養(yǎng)基法檢測產(chǎn)胺菌

將細菌分別劃線于相應的3種生物胺檢測平板，30℃培養(yǎng)5 d，記錄顏色變化，結(jié)果以黃色為陰性，紫紅色或紫色為陽性。

1.2.2特異序列PCR擴增檢測產(chǎn)胺細菌

細菌DNA提取：菌株接種于MRS培養(yǎng)基中30℃活化12 h，吸取1 mL菌液，8000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌水洗滌2次，加入50 μL雙蒸水重懸菌體，制成菌懸液。按照天根DP302細菌基因組提取試劑盒說明提取細菌基因組。

引物：酪氨酸脫羧酶引物TD2(5'-ACTTAGTCAACCATRTTGAA- 3')/ TD5(5'- CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3')，目標片段1132 bp；組氨酸脫羧酶引物HDC1 (5'-ATGTCAGAGTTTGATAAAAAG-3')/HDC2(5'-TTAATAATTGATGTTTCCACC-3')，目標片段904 bp。

25μL反應體系：2×Tapmastermix12.5μL，引物(10μM) 各1 μL，模板DNA2 μL，加雙蒸水補足至25 μL。

PCR反應條件：95℃預變性，5 min；循環(huán)次數(shù)30次；95℃變性，30 s，52℃退火，1 min，72℃延伸，2 min；72℃終延伸，10 min。

本實驗選用已報道的組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因擴增引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成，按照上述25 μL反應體系和PCR反應條件分別對組氨酸脫羧酶基因和酪氨酸脫羧酶基因進行序列擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，4℃保存。

1.2.3 HPLC法分析細菌產(chǎn)胺情況

菌株接種于MRS培養(yǎng)基活化18 h，然后接種于添加氨基酸和輔酶的改良MRS生物胺檢測培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5 d后檢測培養(yǎng)液中的腐胺、酪胺和組胺含量，以不接種的培養(yǎng)基作空白。

2　結(jié)果與分析

2.1顯色培養(yǎng)基檢測產(chǎn)胺細菌

將41株細菌分別劃線于組胺、腐胺和酪胺檢測平板上，30℃培養(yǎng)，記錄顏色變化，如圖1，可以明顯觀察到黃色與紫色（紫紅）的對比。隨著培養(yǎng)時間的延長，平板顏色逐漸出現(xiàn)變化，且顏色變化與生長時間和菌苔量均有關(guān)：不同菌株出現(xiàn)顏色變化的時間不同；已經(jīng)出現(xiàn)顏色變化的培養(yǎng)基隨時間變化顏色更加鮮明（即黃色更黃，紫紅色更深）；所有菌株在培養(yǎng)5 d后，顏色不再變化。

41株細菌檢測結(jié)果匯總見表1，結(jié)果表明：41株菌中，產(chǎn)組胺、酪胺和腐胺的比例分別為39.0 %、56.1 %和31.7 %，7株菌的3種胺檢測平板均為陰性；14株短乳桿菌中5株產(chǎn)組胺、7株產(chǎn)酪胺、6株產(chǎn)腐胺；6株干酪乳桿菌中3株產(chǎn)組胺、4株產(chǎn)酪胺、4株產(chǎn)腐胺；6株植物乳桿菌中3株產(chǎn)組胺、2株產(chǎn)酪胺、2株產(chǎn)腐胺；8株羅旺促桿菌中3株產(chǎn)組胺、7株產(chǎn)酪胺，但無菌株產(chǎn)腐胺；L4和L23檢測結(jié)果為產(chǎn)組胺和酪胺，不產(chǎn)腐胺；L47和L2檢測只產(chǎn)酪胺。產(chǎn)胺的菌株無菌種、菌屬特異性，但有菌株特異性。

圖1 生物胺檢測平板結(jié)果

2.2特異序列PCR擴增檢測產(chǎn)組胺和酪胺細菌

酪氨酸脫羧酶基因和組氨酸脫羧酶PCR擴增條帶的電泳圖如圖2，擴增條帶與目標條帶大小相符，且條帶清晰，方法穩(wěn)定，說明該方法可用于檢測組胺和酪胺產(chǎn)生菌。41株菌的PCR檢測結(jié)果見表1。結(jié)果表明：41株菌中，產(chǎn)組胺、酪胺的比例分別為24.4 %和53.7 %，15株菌的酪氨酸脫羧酶和組氨酸脫羧酶的擴增結(jié)果均為陰性；10株菌攜帶組氨酸脫羧酶基因，其中14株短乳桿菌中6株檢出，6株干酪乳桿菌中3株檢出，另有1株羅旺醋桿菌；23株菌攜帶酪氨酸脫羧酶基因，14株短乳桿菌全部檢出，6株干酪乳桿菌中3株檢出，6株植物乳桿菌中4株檢出，另有1株羅旺醋桿菌和1株戊糖片球菌。其他菌檢測不到目標條帶。綜上分析，短乳桿菌攜帶這2種脫羧酶基因的比例最大。

注：左為tdc引物TD2/ TD5，右為hdc引物HDC1/ HDC2；M.maker DL2000；泳道1～9依次為L2、L3、L5、L6、L7、L36、L37、L40、L46 PCR產(chǎn)物。圖2 細菌酪氨酸脫羧酶基因和組氨酸脫羧酶擴增序列電泳圖

2.3 HPLC法分析細菌產(chǎn)胺能力

按照1.2.3方法對41株分離菌的產(chǎn)生物胺的能力進行初步評價，檢測結(jié)果見表1和表2。結(jié)果表明：41株菌中，產(chǎn)組胺、酪胺和腐胺的比例分別為26.8 %、87.8 %和43.9 %，2株菌的3種培養(yǎng)基中未檢出3種胺；醋桿菌和芽孢桿菌不產(chǎn)生組胺，只有1株片球菌L4產(chǎn)生少量組胺，28株乳桿菌中有2株菌產(chǎn)組胺含量在2.00～10.00 mg/L，另外有8株乳桿菌也產(chǎn)生少量組胺；41株細菌中產(chǎn)酪胺的細菌數(shù)最多，只有4株不產(chǎn)酪胺，產(chǎn)酪胺最多的菌集中在短乳桿菌，有10株短乳桿菌產(chǎn)酪胺的量超過50.00 mg/L，2株干酪乳桿菌、2株植物乳桿菌和2株芽孢桿菌產(chǎn)酪胺的含量在10.00～50.00 mg/L之間；產(chǎn)腐胺的菌也多屬于乳酸菌，尤其是短乳桿菌和干酪乳桿菌。

綜上分析，細菌產(chǎn)生物胺的能力無種屬特異性，但短乳桿菌中產(chǎn)生物胺的菌株數(shù)量和生物胺含量高的菌株數(shù)量都比其他菌種大；細菌產(chǎn)生物胺的能力有菌株特異性，即同種屬不同菌株產(chǎn)生物胺的能力不同。

2.4檢測產(chǎn)胺微生物的方法比較

顯色培養(yǎng)基法、特異序列PCR法和HPLC法檢測41株產(chǎn)胺微生物，檢測結(jié)果進行對比，見表1。顯色培養(yǎng)基檢測結(jié)果表明，23株菌中至少1種胺的檢測平板為陽性；PCR快速檢測結(jié)果表明，25株菌攜帶組氨酸或酪氨酸脫羧酶基因，HPLC法表明39株菌的培養(yǎng)液檢測至少含有1種胺。3種檢測方法結(jié)果不完全相符，但大致相同，說明3種方法有各自的優(yōu)點和缺陷性，互補使用能夠準確分析待測細菌產(chǎn)生物胺的情況。

3種檢測方法各有利弊。顯色培養(yǎng)基法受顯色劑、pH值、氧氣等諸多因素影響，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象，但檢測周期短，操作簡單，成本低，可以作為初步篩查乳酸菌產(chǎn)胺情況的手段。PCR檢測技術(shù)快速、簡便，但檢測到的陽性菌僅說明其攜帶脫羧酶基因，具有產(chǎn)生物胺的潛在可能性，但基因是否表達和脫羧酶是否具有活性都是不確定的，因此此方法是具有前瞻性的方法。HPLC法可以直接分析培養(yǎng)液中的生物胺種類和含量，比較各菌株之間的產(chǎn)胺能力，但僅能說明在某一特定條件下的細菌產(chǎn)胺情況，受培養(yǎng)基質(zhì)等諸多因素的影響。

3　小結(jié)與討論

表1 41株細菌產(chǎn)胺能力的3種方法檢測結(jié)果

細菌代謝是否產(chǎn)生物胺及產(chǎn)生物胺的能力無種屬特異性，但有菌株特異性。

細菌代謝氨基酸產(chǎn)生相應生物胺應是黃酒生物胺的主要來源，尤其是乳酸菌。短乳桿菌從產(chǎn)生物胺的菌株數(shù)量比和產(chǎn)胺能力強的菌株數(shù)量比來看都是對黃酒生物胺影響最大的菌株，且短乳桿菌產(chǎn)酸有惡臭[2]，會影響黃酒的風味品質(zhì)。

芽孢桿菌和醋酸菌為黃酒釀造有害菌，因此應嚴格控制。乳酸菌是黃酒釀造過程中必不可少的微生物，也是黃酒生物胺的主要來源。研究發(fā)現(xiàn)，許多乳酸菌不產(chǎn)生物胺或只產(chǎn)生少量毒性較小的生物胺，如干酪乳桿菌L37。另外，已有報道許多細菌能降解生物胺，這些細菌代謝產(chǎn)生胺氧化酶，催化生物胺生成醛[12-13]。因此，高效利用此類無氨基酸脫羧酶活性或胺氧化酶活性較大的優(yōu)良乳酸菌，實現(xiàn)混合菌株的現(xiàn)代化和機械化發(fā)酵形式，是解決黃酒生物胺安全問題最有效和最根本的措施，如生物酸化浸米[14-15]。但目前黃酒釀造技術(shù)相對落后，要想實現(xiàn)現(xiàn)代化發(fā)酵形式存在很多困難，也需要更加深入的研究。

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Detection of Biogenic Amines Produced by Predominant Bacteria in Yellow Rice Wine Brewing Process

ZHANG Fengjie, WANG Deliang，XUE Jie and YAN Yinzhuo
(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027,China)

Abstract:The change of biogenic amines (produced by 41 bacteria strains in yellow rice wine brewing process) content in decarboxylase liquid culture medium was analyzed by three methods including chromogenic medium method, decarboxylase sequence specific PCR and HPLC. The results showed that the three methods obtained similar results, and the complementary use of the three methods could accurately analyze biogenic-amines-producing status as follows: over 53.7 % of 41 bacteria strains could produce tyramine, over 31.7 % of them could produce putrescine and over 24.3 % of them could produce histamine; 14 strains of Lactobacillus brevis were carrying a tyrosine decarboxylase gene and tyramine yield from 11 strains of them exceeded 50.00 mg/L, and most of them could produce various biogenic amines (it could be inferred that those bacteria strains had the strongest influence on biogenic amines content in yellow rice wine); whether bacterial metabolism produced biogenic amines was not species-specific, but strains-specific.

Key words:yellow rice wine; bacteria; biogenic amines; chromogenic medium; PCR; HPLC

作者簡介：張鳳杰，女，碩士，工程師，主要從事黃酒釀造研究，E-mail：zhangfengjie86@126.com。

收稿日期：2015-11-16

基金項目：科技部院所基金項目（2014EG111217），國家自然科學基金青年基金（31401680）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015436

中圖分類號：TS262.4；TS261.4；TS261.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0017-04

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1742.007.html。