聶韡+房海靈+鄧紹勇+朱培林

摘要： 采用超聲提取廣東紫珠中的連翹酯苷B和金石蠶苷，用HPLC法測(cè)定其含量，并考察其與抗氧化活性的相關(guān)性。色譜柱為sunfire C18 4.6 mm×250 mm色譜柱；流動(dòng)相為乙腈：水（含0.1%甲酸）的溶液（18 ∶ 82）；檢測(cè)波長(zhǎng)為332 nm。抗氧化活性采用DPPH法和鐵氰化鉀還原法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果，廣東紫珠藥材中連翹酯苷B和金石蠶苷含量最高的分別來(lái)自江西武寧和萍鄉(xiāng)蘆溪，相關(guān)性分析結(jié)果表明，連翹酯苷B和金石蠶苷含量與廣東紫珠抗氧化能力均有一定的正相關(guān)性。表明不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材中連翹酯苷B和金石蠶苷的含量有顯著差異；苯乙醇苷類成分為廣東紫珠中主要的抗氧化成分，與自由基清除率和總還原力呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 廣東紫珠；連翹酯苷B；金石蠶苷；抗氧化活性

中圖分類號(hào)： R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0273-03

廣東紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）為馬鞭草科紫珠屬多年生落葉小灌木，莖枝以及葉入藥，收錄于2010版國(guó)家藥典，具有收斂止血、清熱解毒等作用[1]。廣東紫珠以地上部位入藥，其中的苯乙醇苷類成分被認(rèn)為是其主要化學(xué)成分，目前，研究者從中分離到10余種該類化合物[2-3]。相關(guān)研究表明，植物中的苯乙醇苷類成分具有較好的抗氧化活性[4]。相關(guān)學(xué)者對(duì)廣東紫珠的抗氧化作用進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，廣東紫珠的各極性部位均有不同程度清除 DPPH·、OH·的能力[5]。目前，對(duì)廣東紫珠藥材的抗氧化活性研究還較少，苯乙醇苷類具體成分與抗氧化能力之間的相關(guān)性研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)首先利用HPLC法測(cè)定了12個(gè)不同產(chǎn)地的廣東紫珠中連翹酯苷B和金石蠶苷2種苯乙醇苷類成分，同時(shí)測(cè)定了12個(gè)不同產(chǎn)地廣東紫珠的DPPH清除率和總還原力，并對(duì)二者數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，對(duì)廣東紫珠藥材的抗氧化作用進(jìn)行研究，以期為更好地綜合開(kāi)發(fā)利用廣東紫珠資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器2489，美國(guó)Waters公司生產(chǎn)；UV-752紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；CP214型分析天平，奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)；超聲清洗器，潔康超聲波有限公司生產(chǎn)；超聲波功率 120 W，頻率40 kHz；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮公司生產(chǎn)。

1.2 藥品

2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）購(gòu)于西格瑪公司上海辦事處；連翹酯苷B和金石蠶苷對(duì)照品購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥有限公司，純度經(jīng)檢驗(yàn)大于98%；乙腈為色譜純鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、甲酸等均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

1.3 材料

廣東紫珠藥材采自12個(gè)不同產(chǎn)地，藥材來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物廣東紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）的地上部分。

1.4 方法

1.4.1 樣品溶液的制備

1.4.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取連翹酯苷和金石蠶苷對(duì)照品各5.00 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，精確量取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，混勻，制得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣前用微孔濾膜過(guò)濾，去雜質(zhì)，備用。

1.4.1.2 樣品溶液的制備 取干燥廣東紫珠藥材，粉碎，過(guò)50目篩，精確稱定2 g，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇20 mL，36 ℃超聲提取30 min，提取2次，靜置，過(guò)濾，合并2次濾液，并濃縮定容至20 mL，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.4.2 廣東紫珠中苯乙醇苷成分含量測(cè)定 色譜條件：色譜柱為sunfire C18 4.6 mm×250 mm色譜柱；流動(dòng)相為乙腈 ∶ 水（含0.1%甲酸）為18 ∶ 82；檢測(cè)波長(zhǎng)為332 nm；流速為 1 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4.3 抗氧化活性測(cè)定方法

1.4.3.1 自由基清除活性測(cè)定方法（DPPH法）[6] DPPH用無(wú)水乙醇配制成0.039 4 mg/mL的溶液，置于棕色瓶中備用。取各廣東紫珠藥材提取液（按照“1.4.1.2”節(jié)的方法制備，并稀釋至濃度為0.1 mg/mL）3 mL，加入3 mL DPPH 標(biāo)準(zhǔn)液，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光值Di；以乙醇代替樣品溶液做空白試驗(yàn)，在 517 nm處測(cè)吸光值D0；另取3 mL溶液加3 mL 乙醇測(cè)得吸光度為Dj。根據(jù)以上數(shù)據(jù)算出清除率：

清除率=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。

1.4.3.2 總還原力測(cè)定法（鐵氰化鉀法）[7] 在2.5 mL pH值6.6磷酸緩沖溶液中加入1 mL廣東紫珠樣品溶液（按照“1.4.1.2”節(jié)的方法制備，并稀釋至濃度為2.5 mg/mL）、2.5 mL 1% 鐵氰化鉀，混合物在 50 ℃恒溫條件下，加熱 20 min。急速冷卻，加2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻后以3 000 r/min 離心10 min。取上層清液 2.5 mL，加2.5 mL蒸餾水再加0.5 mL 0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min 后，在700 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣東紫珠中連翹酯苷B和金石蠶苷含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 分別精確稱取連翹酯苷B、金石蠶苷各5 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得對(duì)照品溶液。分別精確量取1 mL，混合，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣體積分別為1、4、8、12、16、20 μL，測(cè)定連翹酯苷B、金石蠶苷的峰面積，分別以連翹酯苷B、金石蠶苷的量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，得到連翹酯苷B的回歸方程為：y=886 531x+284 290，r=0.995 1；金石蠶苷的回歸方程為：y=982 413x+371 749，r=0.9995。結(jié)果表明，連翹酯苷B和金石蠶苷在0.25～5.0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC圖見(jiàn)圖1、圖2。

2.1.2 精密度 取2種對(duì)照品的混合溶液，注入液相色譜柱，進(jìn)樣量10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定2種標(biāo)準(zhǔn)品峰面積值，計(jì)算RSD值分別為連翹酯苷B 0.89%，金石蠶苷0.41%，結(jié)果表明，本測(cè)定方法有較好的精密度。

2.1.3 穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣1次，測(cè)定連翹酯苷B、金石蠶苷的峰面積值，計(jì)算RSD值分別為連翹酯苷B 1.86%，金石蠶苷1.51%，結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2.1.4 重復(fù)性 稱取廣東紫珠藥材粉末0.5 g，平行6份，按“1.4.1.2”節(jié)的方法制備6份供試品溶液，各取10 μL分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定連翹酯苷B、金石蠶苷的峰面積值，計(jì)算RSD值分別為連翹酯苷B 0.89%，金石蠶苷0.93%。結(jié)果表明，本測(cè)定方法有較好的重復(fù)性。

2.1.5 加樣回收率 采用加樣回收法測(cè)定回收率。稱取廣東紫珠藥材粉末6份，每份約0.5 g，精確稱定，分別加入對(duì)照品粉末各5 mg，按“1.4.1.2”節(jié)的方法制備6份供試品溶液。測(cè)定連翹酯苷B、金石蠶苷的含量，計(jì)算求得連翹酯苷B的平均回收率為98.03%，RSD為0.66%；金石蠶苷的平均回收率為98.15%，RSD為0.51%。

2.2 樣品含量測(cè)定

取各產(chǎn)地樣品，按照“1.4.1.2”節(jié)的方法進(jìn)行樣品溶液制備，并按照“1.4.2”節(jié)的方法測(cè)定不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材中連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。來(lái)自12個(gè)不同產(chǎn)地的廣東紫珠，其連翹酯苷B、金石蠶苷含量均符合2010版《中國(guó)藥典》二者之和不得低于0.5%的要求，但各產(chǎn)地之間含量差異較為顯著，其中來(lái)自蘆溪及武寧的廣東紫珠樣品的連翹酯苷B、金石蠶苷含量明顯高于其他產(chǎn)地，而余江、安遠(yuǎn)、廣東南雄產(chǎn)地的廣東紫珠中連翹酯苷B、金石蠶苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他各產(chǎn)地。

2.3 樣品抗氧化活性測(cè)定

取各產(chǎn)地樣品，按照“1.4.3”節(jié)的方法測(cè)定不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材的抗氧化活性。由表3可見(jiàn)，各產(chǎn)地的廣東紫珠樣品抗氧化活性差別很大，來(lái)自廣西桂林、江西宜春、江西九江武寧、江西萍鄉(xiāng)萬(wàn)寒寨、江西萍鄉(xiāng)蘆溪的廣東紫珠藥材樣品清除自由基能力較強(qiáng)，江西余江產(chǎn)的廣東紫珠藥材樣品清除自由基能力最弱。廣西桂林、江西宜春、江西萍鄉(xiāng)萬(wàn)寒寨、江西井岡山、江西九江武寧產(chǎn)的廣東紫珠藥材總還原力較強(qiáng)，江西余江產(chǎn)的廣東紫珠藥材樣品總還原力最弱。

2.4 廣東紫珠藥材中苯乙醇苷含量與抗氧化活性的雙變量相關(guān)性分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，分析不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材樣品連翹酯苷B和金石蠶苷的含量與抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果的pearson相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4，雙變量相關(guān)分析是研究變量之間密切程度的一種統(tǒng)計(jì)方法，2個(gè)因素之間的關(guān)系越密切，其相關(guān)系數(shù)越大。結(jié)果表明，連翹酯苷B和金石蠶苷與DPPH清除自由基能力具有顯著的正相關(guān)性；與總還原力具有正相關(guān)。雙變量相關(guān)分析結(jié)果表明，廣東紫珠中苯乙醇苷類成分的含量與抗氧化活性具有明顯的相關(guān)性，但是抗氧化活性是不同物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單的相關(guān)分析不能準(zhǔn)確、全面地反映二者之間的關(guān)系，在今后研究中還需進(jìn)行進(jìn)一步分析。

3 討論

流動(dòng)相的考察。分別考察了甲醇-水、乙腈-水2種基本流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈-水為流動(dòng)相系統(tǒng)的色譜峰峰形較好，且考慮到連翹酯苷B和金石蠶苷2種化學(xué)成分含有酚羥基，略顯酸性，因此，嘗試在流動(dòng)相中加入少許酸以調(diào)節(jié)峰形。分別試驗(yàn)了0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.05%三氟乙酸、0.2% 磷酸，結(jié)果表明，流動(dòng)相中加入少許酸可顯著調(diào)節(jié)色譜峰峰形，且4種酸的效果基本相似，但考慮到磷酸黏度較大，對(duì)儀器和柱子損傷較大；三氟乙酸價(jià)格較貴；且乙酸相比甲酸沸點(diǎn)高，不易揮發(fā)，因此選擇乙腈-水（0.1%甲酸）為最佳流動(dòng)相。最后確定HPLC色譜條件為：以乙腈-水（0.1%甲酸）為流動(dòng)相系統(tǒng)；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：332 nm；流速：1 mL/min。

眾多文獻(xiàn)報(bào)道，苯乙醇苷類成分具有較強(qiáng)的抗氧化活性，而廣東紫珠藥材中主要的化學(xué)成分也是苯乙醇苷類成分，因此理論上廣東紫珠藥材也應(yīng)該是一種具有較強(qiáng)抗氧化活性的中藥材。本研究結(jié)果表明，廣東紫珠藥材具有顯著的清除自由基作用，總還原力也較強(qiáng)；相關(guān)性分析結(jié)果也顯示抗氧化活性和苯乙醇苷類成分的含量具有正相關(guān)性。廣東紫珠在抗氧化方面會(huì)有很好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果也為廣東紫珠藥材抗氧化活性的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。

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