摘要：目的 通過檢測(cè)和觀察母嬰分離致大鼠海馬區(qū)KLK8的分泌表達(dá)水平變化，探討新生期母嬰分離導(dǎo)致大鼠成年后行為異常的可能機(jī)制。方法 取新生Wistar大鼠24只，即刻分為對(duì)照組和分離組，12只為一組，其中將分離組的Wistar鼠在出生后的次日與母親分離，對(duì)照組大鼠與母鼠同籠。出生6周后，處死Wistar大鼠，取海馬組織，HE染色后切片，取出大鼠海馬，檢測(cè)其海馬組織中klk8的水平。應(yīng)用Image-Pro Plus （IPP） 6.0軟件系統(tǒng)對(duì)免疫組化多個(gè)圖像逐一做半定量分析。結(jié)果 ：經(jīng)過母嬰分離的Wistar大鼠，在其成年后，kLK8的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯降低 （P<0.01），提示這種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 大鼠在新生期進(jìn)行母嬰分離，可致大鼠海馬KLK8的表達(dá)出現(xiàn)下降，這對(duì)神經(jīng)信號(hào)可產(chǎn)生影響，使其突觸的可塑性出現(xiàn)變化，隨后對(duì)行為產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞：母嬰分離；海馬；激肽釋放酶8

Effects of Maternal and Neonatal Isolation on KLK8 of Hippocampus in Neonatal Rats

ZHANG Lu1，DONG Wen-bin2

（1.Neonatal Department，Maternal and Child Health Care Hospital of Luzhou，Luzhou 646000，Sichuan，China；2.Neonatal Department，The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Abstract：Objective To detect the expression level of KLK8 in rats' hippocampal tissue after maternal separation， and explore the potential mechanism of rats' abnormal behavior resulted from maternal separation in neonatal period. Methods 24 Wistar neonatal rats were divided into maternal separation group and control group. Nothing was done to the rats in the control group. After 6 weeks， rats were killed.After the hippocampus tissue were determined by use of HE staining ， The expression of KLK8 in rat's hippocampal tissue were detected by immunohistochemistry. Image-Pro Plus software which were used to semiquantitative assessment the immuneohistochemical images. Results Immunohistochemistry showed that KLK8 expression level in hippocampal tissue were significantly decreased in NMS group compared with the control group （P<0.01）. Conclusion The expression of KLK8 were decreased in hippocampatissue after maternal separation， may to a certain extent affected the neural signal transduction and synaptic plasticity，which are possibly related to the rats' abnormal behavior.

Key words：Maternal separation； Hippocampus； Tissue kallikrein 8； Abnormal behavior

研究證實(shí)，早期應(yīng)激事件會(huì)導(dǎo)致成人后發(fā)生心理疾病，例如，在童年的家庭暴力，在成年后很容易出現(xiàn)心境障礙或創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic disorder，PTSD）[1-3]。

當(dāng)代研究表明，長時(shí)間的母嬰分離（Neonate Mother Separation，NMS）可能造成成年后學(xué)習(xí)記憶力減退，認(rèn)知障礙，還會(huì)引起焦慮樣的行為等，過早的母嬰分離會(huì)導(dǎo)致人體應(yīng)激系統(tǒng)功能障礙和異常行為，這種負(fù)面影響在青少年時(shí)期甚至成年后依然存在[4]。由母嬰分離的大鼠動(dòng)物模型可知，如果在大鼠新生期給以母嬰分離后，大鼠成年后自發(fā)活動(dòng)減少，出現(xiàn)認(rèn)知力差，精神焦慮抑郁，對(duì)內(nèi)臟疼痛更加敏感，神經(jīng)元重塑也會(huì)受損害[5-6]。

組織激肽釋放酶（tissue kallikrein，KLK）是一種分泌型絲氨酸蛋白酶，參與學(xué)習(xí)和記憶的過程。人類的KLK8分布在許多正常組織，包括皮膚，食道，睪丸，扁桃體，腎，乳腺表達(dá)，和唾液腺[7]，越來越多的證據(jù)表明在發(fā)展神經(jīng)蛋白酶，成熟，老化和認(rèn)知功能的方面。

研究表明，就發(fā)育水平而言，出生后2周歲兒童的發(fā)育水平與28 d的大鼠發(fā)育程度相當(dāng)[8]，本研究在前期建立大鼠母嬰分離模型基礎(chǔ)上，以KLK8為出發(fā)點(diǎn)，探討母嬰分離的大鼠海馬KLK8誘導(dǎo)表達(dá)水平的變化，以研究新生期母嬰分離可能會(huì)導(dǎo)致大鼠成年后異常行為的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 我們采用3月健康Wistar大鼠（由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），其中雄性5只，雌性10只，均未進(jìn)行交配，在西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)，大鼠可以自由飲水和進(jìn)食。體重為190～300 g，按雌雄2∶1合籠成功交配后，取出孕鼠，單獨(dú)喂養(yǎng)。孕鼠生產(chǎn)后，將一只哺乳期大鼠和12只新生鼠同籠喂養(yǎng)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 激肽釋放酶-8抗體 bs-5871R Rb a KlK8：北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國；SP免疫組化試劑盒： 北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國。

1.3方法

1.3.1模型建立及實(shí)驗(yàn)分組[9] 取新生Wistar大鼠24只，分組為對(duì)照組，分離組兩組，12只為一組，其中將分離組的大鼠在出生后的第2 d與哺乳母鼠分離，3 h/d，3 h后將新生的Wistar大鼠送回籠中與哺乳母鼠相聚，總共21 d，對(duì)照組大鼠與母鼠同籠。正常喂養(yǎng)。

2.2灌注固定和取材 大鼠出生8 w后取材，麻醉后斷頭處死，手術(shù)取出腦組織，經(jīng)過固定，脫水，浸透，包埋，取冠狀位海馬切片，HE染色，

2.4結(jié)果分析 切片中包漿中以出現(xiàn)棕黃色顆粒可視為陽性，在Olympus光鏡下（10×40），用圖文拍照軟件將每張切片取5個(gè)不同視野拍照。采用Image-Pro Plus（IPP）6.0圖象分析體系對(duì)所拍攝的圖象做半定量分析，測(cè)定免疫反應(yīng)產(chǎn)物KLK8的平均吸光度值（average optical density.AOD），取平均值，作為此片的光密度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理 采用SPSS 16.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將所有計(jì)量資料表示采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），用單因素方差比較分析，t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

檢測(cè)出經(jīng)過新生期母嬰分離后的大鼠海馬組織KLK8的表達(dá)水平 陽性標(biāo)準(zhǔn)為：棕黃色產(chǎn)物，呈顆粒狀，KLK8主要在海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過NMS的Wistar大鼠在成年以后，KLK8表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯降低（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1，圖1。

3 討論

有報(bào)道稱電生理和行為研究中發(fā)現(xiàn)組織KLK8影響海馬的重塑[10]，KLK8是激肽釋放酶家族的重要成員，屬于絲氨酸蛋白酶，KLK8廣泛存在于組織和體液中，在腦和皮膚、乳腺、卵巢等中都檢測(cè)出了它的分泌水平，特別是，在腦海馬中高表達(dá)，和學(xué)習(xí)記憶，神經(jīng)發(fā)育相關(guān)。它可以通過參與E-LTP，參與降解L1和影響胞外蛋白酶來參與海馬突觸重塑。

本試驗(yàn)中證明新生期母嬰分離會(huì)使大鼠海馬中KLK8分泌水平下降，該變化會(huì)影響海馬突觸的重塑，并影響神經(jīng)元的功能，從而影響大鼠的記憶和認(rèn)知功能。

結(jié)論母嬰分離后的Wistar大鼠，KLK8在海馬中的表達(dá)量一直低于未進(jìn)行母嬰分離的對(duì)照組，KLK8表達(dá)的下降可能導(dǎo)致大鼠記憶和認(rèn)知障礙。

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編輯/張燕