Rh血型系統(tǒng)是紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最為復(fù)雜的血型系統(tǒng)之一，具有復(fù)雜的遺傳多態(tài)性，其臨床意義僅此于ABO血型系統(tǒng)。Rh血型系統(tǒng)目前已發(fā)現(xiàn)49種抗原，以C、e、D、E、e這5種抗原在臨床上最為重要，尤其是D抗原，它是除ABO血型系統(tǒng)外最強(qiáng)的紅細(xì)胞抗原，具有極強(qiáng)的免疫原性，是造成遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)最常見的原因[1]。因此，鑒定RhD抗原表型被列為臨床輸血檢測常規(guī)項(xiàng)目[1]。編碼Rh血型抗原為2個(gè)高度同源性的基因：RhD基因和RhCE基因。RhD編碼D抗原，RhCE編碼CcEe抗原。近年來，有些研究發(fā)現(xiàn)一些血清學(xué)初篩陰性的個(gè)體經(jīng)進(jìn)一步檢測，發(fā)現(xiàn)一部分人有D抗原的存在。因此，為了解萍鄉(xiāng)地區(qū)Rh陰性人群基因多態(tài)性狀態(tài)，經(jīng)序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）方法進(jìn)行基因?qū)W檢測，比較血清學(xué)結(jié)果與基因?qū)W結(jié)果的異同。

1資料與方法

1.1一般資料 收集我院2011年5月～2015年1月住院及門診患者2035例標(biāo)本進(jìn)行了RhD抗原檢測，RhD陰抗原性率為0.88%[2]，對130例RhD陰性標(biāo)本進(jìn)行了檢測，其中男性60例，女70例，年齡20～75歲。標(biāo)本為采用EDTA抗凝的全血3 ml。

1.2儀器與試劑 美國ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀，Thermo離心機(jī)。Alphalmager凝膠成像系統(tǒng)，Tanon EPS 300電泳儀，紫外分光光度計(jì)，日本富士DNA提取試劑盒，天津秀鵬生物技術(shù)有限公司的RhD基因檢測試劑盒，江陰力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司的RhD血型定型試劑。

1.3方法

1.3.1RhD血型血清學(xué)鑒定 將血樣混勻洗滌3次，配成5%紅細(xì)胞懸液，取1滴加入試管中，再向試管中加入2滴IgG的抗D試劑，37℃孵育30 min。然后用生理鹽水反復(fù)洗滌3次，棄上清液，再加入廣譜抗人球蛋白試劑，1000 r/min離心1min，觀察結(jié)果。有凝集者為RhD陽性，無凝集者為RhD陰性。

1.3.2RhD血型基因?qū)W檢測

1.3.2.1基因組DNA提取 采用日本富士DNA提取試劑盒提取基因組DNA，嚴(yán)格按說明書操作，紫外分光光度計(jì)檢測OD26010D280，以確定DNA濃度及純度，將提取好的DNA置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 PCR-SSP 采用天津秀鵬生物技術(shù)有限公司的RhD基因檢測試劑盒，擴(kuò)增參數(shù)為96℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；96℃20 s 68℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；96℃ 20 s 65℃ 50 s 72℃ 45 s，18個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；4℃保存。

1.3.2.3電泳及結(jié)果判讀 將上述擴(kuò)增產(chǎn)物5～10 ul轉(zhuǎn)移到2.5%瓊脂糖凝膠孔中，140～150V電泳，10 min后于Alphaimager凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。865 bp為內(nèi)參帶，另一條為特異性擴(kuò)增帶，有特異性擴(kuò)增帶判斷為陽性，無特異性擴(kuò)增帶判斷陰性。

2結(jié)果

130例RhD陰性標(biāo)本中，經(jīng)PCR-SSP方法檢測，10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型。

3討論

Rh血型基因位于人類第1號染色體斷臂34.3～36.1區(qū)域。由RhD基因和RhCE基因緊密串聯(lián)排列組成。RhD基因和RhCE基因高度同源（93.8%）均有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，長度分別為57932 bp和58575 bp，均編碼417個(gè)氨基酸。兩者的第8個(gè)外顯子完全相同，差異較大的是外顯子3、4.5、7、9和內(nèi)含子。

RhD抗原表型除了正常的D陽性和陰性表型外還存在多種D變異表型。這種RhD變異體的形成涉及復(fù)雜的分子生物學(xué)變化，主要為RhD和RhCE等位基因發(fā)生融合、細(xì)胞外環(huán)錯(cuò)義突變，外顯子缺失和等為基因被錯(cuò)換等。D變異體主要包括弱D（weakD）、部分D（partialD）和DEL型。弱D抗原表達(dá)完整但是強(qiáng)度減弱，由基因編碼區(qū)堿基突變造成。中國人群中最為常見的是弱D15。此外，亞洲人群中還分布弱D1型、弱D24型、弱D6型。弱D12型和弱D17型等。部分D抗原表達(dá)不完整，其質(zhì)量發(fā)生變異，與某些抗D試劑不發(fā)生凝集反應(yīng)。中國人群中弱D以RhD-（2-9）-D2等為基因?yàn)橹鳌EL表型比例較高。各種族人群DEL表型的分子機(jī)制也不盡一致。中國人DEL分子機(jī)制主要有外顯子9缺失和RhD1227A兩種。

本研究通過對130例Rh陰性標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行血清學(xué)檢測結(jié)果均為Rh陰性，但基因?qū)W結(jié)果卻有一定的差異，其中檢出10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型.。由此可見，血清學(xué)檢測Rh血型的方法快速簡便，但確實(shí)存在一定的漏檢率。為了避免在血清學(xué)上RhD變異體被誤定為RhD陰性，采用DNA分型技術(shù)來鑒定這些D變異體變得越來越重要。比如血清學(xué)鑒定為RhD陰性，但基因型確為Rh陽性的血液，當(dāng)輸血時(shí)，輸注給Rh陰性的個(gè)體，就會刺激機(jī)體產(chǎn)生RhD抗體，當(dāng)混著再次輸注Rh陰性血液時(shí)，就會出現(xiàn)輸血反應(yīng)。對于RhD陰性女性患者，輸注這種血液，懷孕后發(fā)生新生兒溶血病的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。

綜上所述，對血清學(xué)檢測的RhD陰性標(biāo)本進(jìn)行RhD基因型檢測勢在必行，在不久的將來，相信隨著科研和技術(shù)手段的進(jìn)步，RhD基因分型方法將不斷完善，對溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病等輸血相關(guān)疾病的預(yù)防定會有長足的發(fā)展[1-3]。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉純，劉偉.天津地區(qū)RHD陰性人群基因多態(tài)性分析[J].廣東醫(yī)學(xué)，2012，10，33（20）：3088.

[2]歐陽福桂，劉芳，王長奇.3種RH血型抗原檢測在輸血中的應(yīng)[J].江西醫(yī)藥，2012，2，47（2）：177.

[3]邵超鵬.RHD研究進(jìn)展和中國人RHD研究現(xiàn)在分析[J].中國輸血雜志，2003，16（6）：354-357.編輯/丁一