李耀國，劉文廣，林堅(jiān)士，何毛賢

（1.中國科學(xué)院南海海洋研究所　中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　廣州　510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京　100049）

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馬氏珠母貝SNP標(biāo)記開發(fā)及家系遺傳多態(tài)性分析

李耀國1，2，劉文廣1，林堅(jiān)士1，何毛賢1

（1.中國科學(xué)院南海海洋研究所中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

摘要：利用13個源自轉(zhuǎn)錄組序列的SNP標(biāo)記對3個馬氏珠母貝（Pinctada fucata）家系進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析及聚類分析。結(jié)果顯示，家系1#、3#、6#的平均期望雜合度（He）分別為0.307 8、0.318 9和0.382 7；平均觀測雜合度（Ho）分別為0.342 2、0.341 0和0.394 2；平均多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.243 5、0.247 9和0.297 7。結(jié)果表明，3個馬氏珠母貝家系具低度或中度遺傳多態(tài)性，為馬氏珠母貝內(nèi)SNP應(yīng)用于遺傳多態(tài)性分析等提供了基礎(chǔ)。利用SNP標(biāo)記對3個家系進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)半同胞家系1#和3#在家系及個體聚類中均先聚在一起，然后再與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的家系6#聚在一起。新開發(fā)的SNP標(biāo)記能較準(zhǔn)確地對家系及個體進(jìn)行聚類，為SNP標(biāo)記應(yīng)用于馬氏珠母貝遺傳關(guān)系分析提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬氏珠母貝；SNP；遺傳多態(tài)性；聚類分析

馬氏珠母貝（Pinctada fucata），又名合浦珠母貝，是世界上重要的海水珍珠貝，在中國廣東、廣西、海南沿海有著廣泛分布。海洋貝類養(yǎng)殖過程中普遍存在育種混亂、寄生蟲病及環(huán)境脅迫等問題，給經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)帶來重大損失（Hine etal，2000；Liu etal，2012）。通過常規(guī)的選擇和雜交育種可對海水養(yǎng)殖品種進(jìn)行遺傳改良（湯嬌雯等，2009）。如利用單對配對法構(gòu)建生長快、個體大的馬氏珠母貝家系及定向選擇改良經(jīng)濟(jì)性狀（何毛賢等，2006；何毛賢等，2007）。隨著水產(chǎn)動物的遺傳改良進(jìn)入分子育種時代，利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種可以更準(zhǔn)確地估計個體育種價值及加快育種速度（桂建芳等，2012；Taylor，2014）。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（杜民等，2013）及擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記（秦溱等，2014）、微衛(wèi)星（李小寧等，2009；孫立元等，2014）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記（Jiang et al，2011）以及線粒體DNA標(biāo)記（胡靜等，2014）等已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物遺傳育種研究。

馬氏珠母貝中各種分子標(biāo)記均得到開發(fā)及應(yīng)用。在群體及家系的遺傳多態(tài)性分析方面，王愛民等（2000）利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)記對馬氏珠母貝天然群體及養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析及比較，發(fā)現(xiàn)天然群體的遺傳多樣性大于養(yǎng)殖群體。許成帥等（2013）采用微衛(wèi)星標(biāo)記對合浦珠母貝家系的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)總體上生長較快的家系遺傳參數(shù)平均較大。此外，Huang等（2014）在馬氏珠母貝內(nèi)開發(fā)了一批SNP標(biāo)記并對其群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。在性狀關(guān)聯(lián)分析方面，鄧岳文等（2013）開展了馬氏珠母貝生長性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，檢測到與體質(zhì)量、殼高、殼寬等顯著相關(guān)的標(biāo)記并確定了相應(yīng)性狀的優(yōu)勢基因型。隨著下一代測序技術(shù)的發(fā)展，通過高通量測序在馬氏珠母貝內(nèi)鑒定了大量的SNP標(biāo)記，構(gòu)建了高密度遺傳連鎖圖譜并定位了一批數(shù)量性狀位點(diǎn)（Shietal，2014；Lietal，2014）。在各類分子標(biāo)記中，SNP在基因組中因數(shù)量豐富且易于分型而成為理想的分子標(biāo)記（Jonesetal，2013）。多種方法如四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR（Ye et al，2001），高分辨率溶解曲線法（Yu et al，2011），簡化基因組測序法（Houston etal，2012）等均被用于SNP標(biāo)記分型分析。其中四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR是一種相對簡單、快速有效的SNP分型方法（Zhang et al，2013）。該方法對每個SNP位點(diǎn)設(shè)計四條引物，并在兩條核苷酸特異性引物的3端倒數(shù)第3位引入錯配堿基以提高引物末端堿基結(jié)合特異性。在長牡蠣（Crassostrea gigas Thunber g）（Kong etal，2014）等物種中已利用該方法進(jìn)行SNP分型分析。

目前針對馬氏珠母貝SNP標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用還不是很深入，且尚未有關(guān)于SNP標(biāo)記用于馬氏珠母貝家系及個體聚類分析的相關(guān)報導(dǎo)。該研究基于轉(zhuǎn)錄組測序序列開發(fā)了13個新的SNP標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記對3個馬氏珠母貝家系進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析及聚類分析，為SNP標(biāo)記應(yīng)用于馬氏珠母貝遺傳育種研究提供了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及DNA提取

該研究中馬氏珠母貝家系于2012年4月采用單對配對的方式構(gòu)建，親本選自深圳大鵬澳海區(qū)的養(yǎng)殖群體。3個基礎(chǔ)研究用家系（8月齡貝）分別為：1#（n= 49，個體編號1-49），3#（n= 49，個體編號50～98）和6#（n=56，個體編號99～154），其中1#和3#為具有共同父本的半同胞家系。對3個家系全部個體分別取閉殼肌用95％乙醇固定。采用E.Z.N.A軟體動物DNA提取試劑盒（OMEGA）提取基因組DNA。DNA濃度及質(zhì)量分別通過分光光度計及1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，稀釋至50 ng/μL，-20°C保存。

1.2 SNP分型分析

基于馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（Huang et al，2013），采用SOAPsnp軟件（Li et al，2009）篩選假定的SNP。SNP位點(diǎn)兩端的序列長度不短于100 bp，以適于引物設(shè)計，序列中無不確定堿基，符合上述標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄組序列中SNP位點(diǎn)定義為假定的SNP位點(diǎn)（Huangetal，2014），用于進(jìn)一步驗(yàn)證分析。利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR在線引物設(shè)計程序（http：//cedar.genetics.soton.ac.uk/ public_html/primer1.html）對59個假定SNP位點(diǎn)設(shè)計引物并進(jìn)行分型分析。PCR反應(yīng)體積為25μL，含12.5 μL Premix Ex Taq（Takara），每條引物各0.5 μL（10 pmol/μL），1 μL DNA（50 ng/μL），0.25μLTaq酶（5U/μL）和9.25μLH2O。程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C30s，合適退火溫度下1min，72°C 1min，35個循環(huán)；最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)3.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測后做分型分析。將含有SNP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組序列所對應(yīng)的氨基酸序列在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對尋找同源性序列。將SNP引起的堿基變異與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸密碼子表進(jìn)行比較確定是否引起了編碼氨基酸的變異。

1.3遺傳多態(tài)性分析

SNP位點(diǎn)的最小等位基因頻率（MAF），觀測等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），期望雜合度（He），觀測雜合度（Ho），偏離哈代溫伯格平衡（HW E）的概率均通過POPGENE version 1.32軟件進(jìn)行計算（Yeh etal，1999）。多態(tài)信息含量通過軟件PIC-Calc version 0.6（Shao et al，2013）進(jìn)行計算。

1.4家系及個體聚類分析

基于等位基因頻率（Neiet al，1983），利用PowerMarkerversion 3.25（Liu etal，2005）軟件對馬氏珠母貝1#、3#和6#家系間及個體間遺傳距離進(jìn)行計算。基于非加權(quán)配對算數(shù)平均法，使用MEGA 5（Tamura etal，2011）分別繪制3個家系及個體聚類圖。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 SNP引物序列及變異類型

對59個假定SNP位點(diǎn)進(jìn)行四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR檢測，結(jié)果顯示13個位點(diǎn)具有多態(tài)性，其引物及特征見表1。在59個假定SNP中，C/T轉(zhuǎn)變所占比率最高（33.8％）。其中SNP U101671-455可導(dǎo)致脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔琒NP U101773-373可導(dǎo)致絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?。結(jié)果見表1。

表1　馬氏珠母貝13個SNP標(biāo)記的特征及引物序列

2.2家系遺傳多態(tài)性分析

利用經(jīng)過分型驗(yàn)證的13個SNP標(biāo)記對馬氏珠母貝3個家系進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR如圖1所示。結(jié)果顯示家系1#、3#和6#的平均期望雜合度（He）分別為0.307 8、0.318 9和0.382 7；平均觀測雜合度（Ho）分別為0.342 2、0.341 0和0.394 2。兩個半同胞家系1#和 3#的平均PIC值分別為0.243 5和0.247 9，均屬于較低的多態(tài)性（PIC<0.25）；家系6#的平均PIC值分別為0.297 7，屬于中度多態(tài)性（0.25 < PIC < 0.5）（Botstein，1980）。

續(xù)表1　

表2　SNP標(biāo)記對3個馬氏珠母貝家系遺傳多態(tài)性分析

續(xù)表2　

圖1　馬氏珠母貝SNP位點(diǎn)U101716-392四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR電泳圖（M泳道為100 bp DNA marker，1-6對應(yīng)不同樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；a對應(yīng)外擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為358 bp，b為等位基因G對應(yīng)產(chǎn)物，大小為231 bp，c為等位基因A對應(yīng)產(chǎn)物，大小為183 bp）

2.3馬氏珠母貝家系及個體聚類分析

基于1#、3#和6#家系間及個體間的遺傳矩陣對家系及個體進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。其中a為半同胞家系1#和3#先聚在一起，6#則在另外分支。個體聚類分析中，來自家系1#和3#的個體總體上先聚在一起，再與家系6#的個體聚類。半同胞家系1#和3#的遺傳距離最近（0.054 7），家系3#和6#的遺傳距離最遠(yuǎn)（0.081 4）。

圖2　馬氏珠母貝家系及個體聚類分析a.馬氏珠母貝3個家系聚類圖；b.馬氏珠母貝3個家系全部個體聚類圖，●為1#內(nèi)個體，○為3#內(nèi)個體，□為6#內(nèi)個體。

3討論

3.1 SNP類型

3.2家系遺傳多態(tài)性分析

利用SNP標(biāo)記對馬氏珠母貝3個家系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其平均PIC值分別為0.243 5、0.2479 和0.297 7。相對于許成帥等（2013）報導(dǎo)的利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析合浦珠母貝家系的遺傳多態(tài)性低（殼長速長與慢長家系PIC值分別為0.31和0.39）。該研究中馬氏珠母貝遺傳多態(tài)性處于較低或中等的原因可能有以下兩個方面：一是與微衛(wèi)星標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記的多態(tài)信息含量較低（Kong et al，2014）；二是家系構(gòu)建過程中存在的對性狀（基因型）的選擇，可能降低了該研究中家系的遺傳多態(tài)性。SNP標(biāo)記相對于微衛(wèi)星等DNA標(biāo)記等位基因數(shù)少，但其具有較高比例的非同義突變（如在13 個SNP標(biāo)記中存在兩個非同義突變），可直接產(chǎn)生氨基酸變異，可能更利于開展性狀關(guān)聯(lián)分析及數(shù)量性狀位點(diǎn)定位。家系1#和3#為半同胞家系，根據(jù)SNP標(biāo)記遺傳多態(tài)性分析結(jié)果可知這兩個家系具有相近的遺傳多態(tài)性。家系1#和3#的平均PIC值（0.243 5和0.247 9），平均He值（0.307 8和0.318 9）和平均Ho值（0.342 2和0.341 0）均是3個家系中最接近的，與親緣關(guān)系一致。說明這些SNP標(biāo)記可以用于家系遺傳多態(tài)性分析。

3.3家系及個體聚類分析

分子標(biāo)記中，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（代悅等，2010）、微衛(wèi)星標(biāo)記（杜曉東等,2011）已被用于馬氏珠母貝家系聚類分析，并能正確地對家系進(jìn)行聚類。該研究首次嘗試?yán)肧NP標(biāo)記對馬氏珠母貝家系及個體分別進(jìn)行聚類分析。根據(jù)結(jié)果可知同父異母的半同胞家系1#和3#先聚在一起，再與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的6#聚類。同時從遺傳距離計算的結(jié)果可知家系1#和3#的遺傳距離最近（0.0547），家系6#則在另外的分支，與家系1#及3#的遺傳距離分別為0.0814和0.0613。聚類結(jié)果與三個家系的親緣關(guān)系相符合，表明可通過這些SNP標(biāo)記對馬氏珠母貝家系進(jìn)行準(zhǔn)確的聚類。對3個馬氏珠母貝家系的全部個體進(jìn)行聚類分析的結(jié)果顯示，除小部分個分散分布于其它家系中外，大部分的個體均按照各自家系來源聚在一起。相對于其它分子標(biāo)記如微衛(wèi)星標(biāo)記及擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記，SNP主要由兩個等位基因組成，代表的多態(tài)性相對較低（Kongetal，2014），要想更準(zhǔn)確地對個體進(jìn)行聚類可能需要開發(fā)更多的標(biāo)記來增加聚類能力。

馬氏珠母貝自古以來即是培育優(yōu)良珍珠的母貝。由于過度捕撈及生存的海域環(huán)境受到破壞，其物種資源受到很大的破壞（Liu etal,2012）。人工成功繁殖馬氏珠母貝以來，存在明顯的育種混亂等問題并導(dǎo)致了馬氏珠母貝種質(zhì)衰退，育珠質(zhì)量下降（何毛賢等,2006；王學(xué)穎等，2012）。為解決這些問題，有必要對馬氏珠母貝提純復(fù)壯，以保持其優(yōu)良性狀。傳統(tǒng)的雜交、混合選育、家系構(gòu)建等對馬氏珠母貝優(yōu)良性狀的選擇起到了明顯的作用。而快速發(fā)展的基于基因組的分子標(biāo)記技術(shù)則進(jìn)一步加強(qiáng)了水產(chǎn)動物育種精度及速度。本研究結(jié)合傳統(tǒng)的家系構(gòu)建及快速發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)，利用13個轉(zhuǎn)錄組來源的SNP標(biāo)記進(jìn)行了家系遺傳多態(tài)性分析。三個馬氏珠母貝家系處于較低或中度的遺傳多態(tài)性水平，可能與親本的遺傳背景有關(guān)。因而可有選擇性地對構(gòu)建的家系采用回交等方式恢復(fù)其遺傳多態(tài)性，以利于馬氏珠母貝種質(zhì)資源的保護(hù)。

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對大型植物的監(jiān)測，在植被繁茂季節(jié)對溝道每1km布設(shè)1個調(diào)查點(diǎn)，如遇到生態(tài)條件突變則加測一點(diǎn)，共布設(shè)調(diào)查點(diǎn)9個。每個點(diǎn)根據(jù)實(shí)地特點(diǎn)設(shè)置 1～2個 5 m×5 m的喬灌樣方，2～3 個 1 m×1 m 草本樣方，0～2個1 m×1 m水生植物樣方。調(diào)查植物種類與數(shù)量。

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（本文編輯：袁澤軼）

Developm entof SNP m arkers in Pinctada fucata and its app lication for fam ily genetic analysis

LIYao-guo1,2,LIU W en-guang1,LIN Jian-shi1,HE Mao-xian1
（1.CASKey LaboratoryofTropicalMarine Bio-resourcesand Ecology,Guangdong ProvincialKey LaboratoryofApplied Marine Biology,South China Sea InstituteofOceanology,Chinese AcademyofSciences,Guangzhou 510301,Guangdong,China；2.UniversityofChinese AcademyofSciences,Beijing100039,China）

Abstract：A transcription databasewas tracked to identify and validate SNP markers.A totalof thirteen SNPswere used for genetic analysis in Pinctada fucata.For Pinctada fucata family 1#,3#and 6#,the average expected heterozygosities（He）were 0.307 8,0.318 9 and 0.382 7,respectively；the average observed heterozygosities（Ho）were 0.342 2,0.341 0 and 0.394 2,respectively；and the average polymorphism information contents（PIC）were 0.243 5,0.247 9 and 0.297 7,respectively.Thehalfsibling family 1#and 3#were firstly clustered together in the dendrogram,and then clusteredwith family 6#,which was in accordance with the genetic relationship.The developmentof novel SNPs in Pinctada fucata can provide genetic tools forgenetic diversity analysisand clusteringanalysis.

Keywords：Pinctada fucata;single nucleotide polymorphism;genetic diversity;clusteranalysis

通訊作者：何毛賢，博士，研究員，從事海洋貝類遺傳育種研究。電子郵箱：hmx@scsio.ac.cn。

作者簡介：李耀國（1986-），男，博士研究生，從事海洋貝類遺傳育種研究。電子郵箱：yaoguolijkl@163.com。

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA10A410）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（A201301A03）；廣東省科技計劃（2013B020308005）。

收稿日期：2015-01-08；

修訂日期：2015-04-07

Doi：10.11840/j.issn.1001-6392.2016.01.013

中圖分類號：S968.31

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-6932（2016）01-0096-07