黃　文，李琴，林堅士，何毛賢

（1.中國科學(xué)院南海海洋研究所　中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　廣州　510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京　100039）

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馬氏珠母貝肌肉生長抑制素基因eSNP多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

黃文1，2，李琴1，2，林堅士1，何毛賢1

（1.中國科學(xué)院南海海洋研究所中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100039）

摘要：肌肉生長抑制素myostatin（MSTN），是目前已知抑制肌肉生長最強(qiáng)效的分化因子，具有負(fù)向調(diào)控肌肉生長、發(fā)育的作用，它與生長之間的這種單向作用關(guān)系，使其在養(yǎng)殖生物遺傳改良上具有重要的潛在應(yīng)用價值。文以馬氏珠母貝MSTN基因21個eSNP位點(diǎn)作為候選SNP位點(diǎn)，對106只馬氏珠母貝進(jìn)行基因分型并與8個生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。SNP最小等位基因頻率的范圍為0.028 3～0.490 4，多態(tài)信息含量（PIC）的范圍為0.093 6～0.375 0，觀測雜合度（Ho）及期望雜合度（He）的范圍分別為0.028 3～1.000 0及0.098 9～0.502 7。2個SNP位點(diǎn)與生長性狀顯著關(guān)聯(lián)：g.3154 A>G位點(diǎn)的GG型個體的殼高、殼長、總重、殼重、軟體部重和閉殼肌重顯著大于AG型個體（P<0.05）；g.4379A>G位點(diǎn)GG型個體的殼高、殼長、鉸合線長、總重、軟體部重和閉殼肌重顯著大于AG型個體（P<0.05）。g.3154 A>G位點(diǎn)和g.4379A>G位點(diǎn)間無顯著交互作用。這2個SNP可作為潛在的馬氏珠母貝基因型選擇育種標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：馬氏珠母貝；肌肉生長抑制素MSTN；單核苷酸多態(tài)性；生長性狀；關(guān)聯(lián)分析

目前在水產(chǎn)動物育種領(lǐng)域，研究生長性狀相關(guān)基因主要有兩種方法：基因組測序篩選檢測或稱QTL定位法和候選基因法（candidate gene approach）。其中，候選基因法因具有目標(biāo)明確，檢驗(yàn)效率高，且有費(fèi)用低廉、對群體要求較低、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在研究性狀關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記中，如W ang等（2012）通過對MDA5（黑色素瘤分化相關(guān)基因-5）的5’側(cè)翼區(qū)中的SNP與草魚對GCRV疾病的易感性/抗性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定了與抗性相關(guān)的草魚（Ctenopharyngodon idella）的基因型，魏可鵬等（2012）克隆了建鯉（Cyprinus carpio）IGFBP1基因，并成功篩選到了兩個與增重顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)。

肌肉生長抑制素myostatin（MSTN），是目前已知抑制肌肉生長最強(qiáng)效的分化因子，具有負(fù)向調(diào)控肌肉生長、發(fā)育的作用，它與生長之間的這種單向作用關(guān)系，使其在養(yǎng)殖生物遺傳改良上具有重要的潛在應(yīng)用價值。近年來，myostatin基因及其SNP與多種經(jīng)濟(jì)性狀之間的顯著關(guān)聯(lián)已在雞（Gallus domesticus）（McFarland et al，2007）、馬（Equus caballus）（Li et al，2014）、大口黑鱸（Micropterus salmoide）（于凌云等，2010）和扇貝（Chlamys farreri；Argopecten irradians）（Hu et al，2010；Guo et al，2012）等多個物種中被鑒定，而這種關(guān)聯(lián)性可以為日后開展分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata）是一種重要的海水養(yǎng)殖貝類，利用分子標(biāo)記輔助育種可加快馬氏珠母貝育種進(jìn)程。本研究中以馬氏珠母貝myostatin基因作為生長性狀相關(guān)的候選基因，檢測基因外顯子上的SNP位點(diǎn)（eSNP），并對其基因型與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，同時分析了SNP位點(diǎn)間的聚合效應(yīng)，以期為馬氏珠母貝分子標(biāo)記輔助育種提供潛在的SNP標(biāo)記。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所用的馬氏珠母貝（Pinctada fucata）來源于以生長性狀為選擇指標(biāo)的混合選擇群體第三代，其基礎(chǔ)群體為深圳野生群體，養(yǎng)殖于深圳大鵬澳海區(qū)。隨機(jī)從該群體（8月齡）中取106只貝，測量并記錄每只貝的殼高、殼長、鉸合線長、殼寬、總重、殼重、軟體部重和閉殼肌重，其均值分別為48.45±6.13 mm、46.72±5.92 mm、40.48± 4.39mm、17.28±1.90mm、17.04±5.18 g、9.71± 2.79 g、5.15±1.97 g、0.83±0.39 g。取每只貝的閉殼肌組織于95％乙醇中，-20°C保存。

1.2基因組DNA的提取

使用HiPure Universal DNA Mini Kit提取閉殼肌組織的DNA，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計測量DNA樣品A260/ A280的比值來檢測純度，提取的DNA于-20°C保存。

1.3 SNP位點(diǎn)分型

用于分型用的21個外顯子SNP（eSNP）位點(diǎn)來源于Li等（2014）鑒定的馬氏珠母貝MSTN基因，并根據(jù)其在基因組DNA的位置重新命名。利用Tetra-Primer Arms在線引物設(shè)計程序（http：// primer1.soton.ac.uk/primer1.html）設(shè)計SNP位點(diǎn)的基因分型引物（表1）。Tetra-Primer PCR分型引物包括兩條內(nèi)引物FI、RI及兩條外引物FO、RO，其中兩條內(nèi)引物3'端倒數(shù)第三個堿基引入一個錯配堿基以增加特異性。當(dāng)檢測樣品為雜合型時電泳結(jié)果理論上應(yīng)該有三條帶，包括兩條外引物擴(kuò)增的一條帶（FI、RI），內(nèi)引物和外引物擴(kuò)增的兩條帶（FI、RO）以及（RI、FO）；當(dāng)檢測樣品為純合型時則為兩條帶，包括兩條外引物擴(kuò)增的一條帶（FI、RI），內(nèi)引物與外引物擴(kuò)增條帶中的一條。PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 2.0μL，DNA Taq酶0.125μL，引物（10μM）0.5μL，基因組DNA 0.4μL，ddH2O 3.725μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，1個循環(huán)；94°C變性35 s，最適退火溫度退火40 s，72℃延伸40s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用3.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察電泳圖譜（圖1），確定每個個體的基因型。

1.4 SNP與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

統(tǒng)計群體中SNP堿基置換類型及各種類型的數(shù)量。利用PIC_CALC軟件計算群體中每個SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（polymorphism content information，PIC）。利用Popgene軟件（Yeh etal，1997）計算每個SNP位點(diǎn)在群體中的等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）和觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho），并進(jìn)行哈德-溫伯格平衡（Hardy-W einberg equilibrium，HW E）檢驗(yàn)，SHEsis軟件分析連鎖不平衡。由于總體分布未知，因此對于106只貝生長性狀正態(tài)分布進(jìn)行檢驗(yàn)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，計算結(jié)果顯示8個性狀的P值均大于0.05，即符合正態(tài)分布。采用SPSS 17.0軟件中的GLM程序?qū)?1個SNP位點(diǎn)與各生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到顯著關(guān)聯(lián)生長的SNP位點(diǎn)（P<0.05），并檢驗(yàn)兩位點(diǎn)間是否存在交互作用；對于顯著關(guān)聯(lián)生長性狀SNP位點(diǎn)經(jīng)Levene檢驗(yàn)結(jié)果P值均大于0.05，表明方差齊次，然后采用Sidak法比較g.3154A>G位點(diǎn)不同基因型間的性狀差異，對于g.4379A>G位點(diǎn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較（P<0.05）。

表1　21個SNP位點(diǎn)分型引物

續(xù)表1　21個SNP位點(diǎn)分型引物

圖1　部分個體在位點(diǎn)SNP g.2923C>T的分型結(jié)果（1.GenStar direct-loadTM 100bp DNA LadderMarker；2-13：每個個體的基因型，CC表示純合子，CT表示雜合子）

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 21個SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)統(tǒng)計

在這21個SNP位點(diǎn)中，最常見的突變類型為A/G轉(zhuǎn)換，共有8個位點(diǎn)屬于此類，占SNP位點(diǎn)總數(shù)的38.1％；其次為G/T顛換和C/T轉(zhuǎn)換，各包括5個SNP位點(diǎn)，分別占位點(diǎn)總數(shù)的23.8％。除g.3222A >G、g.4595C>T檢測到一種基因型，g.4379A>G、g.12648C>T檢測到兩種基因型，其他位點(diǎn)3種基因型均能檢出。群體中最小等位基因頻率（minorallele frequency，MAF）的范圍為0.0519～ 0.500 0，多態(tài)信息含量（PIC）的范圍為0.093 6～ 0.375 0，觀測雜合度（Ho）及期望雜合度（He）的范圍分別為0.028 3～1.000 0及0.098 9～0.502 7（表2）。哈德-溫伯格平衡（HW E）檢驗(yàn)結(jié)果表明，21個SNP中有8個符合平衡（表3）。

2.2 SNP與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析及均值比較分析

經(jīng)GLM分析，在這21個SNP位點(diǎn)中，只有g(shù).3154A>G、g.4379A>G這2個位點(diǎn)與生長性狀顯著相關(guān)（P<0.05）（表4-5）。進(jìn)一步分析表明，對于g.3154A>G位點(diǎn)，GG型個體的殼高、殼長、總重、殼重、軟體部重和閉殼肌重顯著大于AG型個體（P<0.05），分別大10.99％、9.08％、26.12％、26.65％、35.28％和43.33％，AA型個體除殼寬顯著大于AG型個體（P<0.05），其他性狀均與另外兩種基因型無顯著差異；g.4379A>G位點(diǎn)，GG型個體的殼高、殼長、鉸合線長、總重、軟體部重和閉殼肌重顯著大于AG型個體（P<0.05），分別大6.20％、6.96％、5.65％、13.58％、18.01％、27.40％（表6）。

對兩個與軟體部重和閉殼肌重都顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)（g.3154A >G位點(diǎn)和g.4379A >G）用SHEsis軟件連鎖不平衡分析，表明這兩個位點(diǎn)連鎖不緊密（D＇= 0.26和R2= 0.04），用GLM做兩因素交互分析，未發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)存在顯著交互作用（表7）。

表2　馬氏珠母貝M STN基因21個eSNP位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率

表3　馬氏珠母貝M STN 21個eSNP位點(diǎn)的群體遺傳參數(shù)

表4　g.3154A>G位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

表5　g.4379A>G位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

表6　兩個顯著關(guān)聯(lián)生長性狀的SNP位點(diǎn)的均值比較分析

表7　g.3154A>G位點(diǎn)和g.4379A>G位點(diǎn)交互作用分析

3討論

有研究表明SNP位點(diǎn)在不同群體中，分布情況具有差異性。Morales-Colli＇o等（2014）在野生群體和養(yǎng)殖群體中對紫扇貝（Argopecten purpuratus）基因上的三個SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一個位于5’-UTR的SNP和一個位于編碼區(qū)的SNP均只出現(xiàn)在野生群體中，另一個位于3＇-UTR 的SNP卻只出現(xiàn)在養(yǎng)殖群體中。Sauvage等（2007）在太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)每60個堿基有一個SNP位點(diǎn)，而非編碼區(qū)每40個堿基就有一個，表明非編碼區(qū)還存在大量SNP位點(diǎn)。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們用于分型的群體僅來自于一個混合選擇群體，屬于人工選育群體；且SNP位點(diǎn)全部來自外顯子區(qū)域，這些可能是導(dǎo)致部分SNP位點(diǎn)基因型未被全部檢出的主要原因。

在馬氏珠母貝MSTN的外顯子中，檢測出21個多態(tài)SNP位點(diǎn)，明顯高于Guo等（2011）在海灣扇貝（Argopecten irradians）MSTN基因外顯子上確定的兩個SNP位點(diǎn)，而Nú?ez-Acu?a等（2014）則在貽貝（Mytilus chilensis）中檢測到37個SNP位點(diǎn)，說明該基因的多態(tài)性水平存在物種間差異。將這21個SNPs的遺傳參數(shù)，如觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He），與Huang等（2014）獲得的馬氏珠母貝SNPs結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)其雜合度和期望雜合度較其高，說明馬氏珠母貝MSTN基因外顯子堿基變異水平較高。

為了探索這些SNP與性狀之間是否存在某些關(guān)聯(lián)性，對SNP基因型和表型進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析。GLM程序分析結(jié)果顯示21個SNP位點(diǎn)中有兩個位點(diǎn)與某些生長性狀顯著關(guān)聯(lián)。從統(tǒng)計結(jié)果上看，g.3154A>G位點(diǎn)GG型個體的殼高、殼長、總重、殼重、軟體部重及閉殼肌重大于AG型基因型個體；g.4379A>G位點(diǎn)GG型個體的殼高、殼長、絞合線長、總重、軟體部重及閉殼肌重大于AG型基因型個體。對于這兩個SNP位點(diǎn)，GG型都為優(yōu)異基因型。同時，這兩個位點(diǎn)與馬氏珠母貝的軟體部重及閉殼肌重顯著關(guān)聯(lián)，因而這兩個位點(diǎn)可能與myostatin基因的表達(dá)密切相關(guān)。根據(jù)前面的分析，GG型為優(yōu)異基因型，我們推測GG型個體myostatin基因的表達(dá)較其他基因型個體較低。類似的研究在扇貝中也有報道，如W ang等（2010）對櫛孔扇貝（Chlamys farreri）基因編碼區(qū)的SNP進(jìn)行鑒定，并將其基因型與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)Cf-MSTN存在兩個SNPs，分別位于外顯子2 和3上，外顯子2上的SNP的GG基因型個體在體重、軟體部重、閉殼肌重、殼長、殼高各項生長指標(biāo)上也均優(yōu)于基因型AA和AG的個體，同時還發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(diǎn)會引起氨基酸變化。在本研究中，g.3154A>G位點(diǎn)和g.4379A>G位點(diǎn)雖位于Pf-MSTN cDNA的開放閱讀框內(nèi)，但不會引起氨基酸的改變，屬于同義突變。然而，近年來很多研究表明，同義突變也能調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，Greenwood等（2003）發(fā)現(xiàn)啟動子和內(nèi)含子同義突變均能夠影響許多基因的轉(zhuǎn)錄效率，Kimchi-Sarfaty等（2007）發(fā)現(xiàn)MDR1基因中的一個同義突變可以改變蛋白的空間結(jié)構(gòu)；Capon等（2004）發(fā)現(xiàn)角膜鎖鏈蛋白基因中的同義突變能提高mRNA分子的穩(wěn)定性。因此，將來對這類SNP繼續(xù)進(jìn)行深入研究很有必要，這有助于闡明myostatin基因變異對馬氏珠母貝生長性狀的影響。

優(yōu)異基因的聚合能得到理想的累加效應(yīng)，基因聚合最早由Yadav等（1990）研究改良芥菜（Brassica juncea）抗逆和抗病性狀時提出。目前，基因聚合效應(yīng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在研究農(nóng)作物和禽畜的經(jīng)濟(jì)性狀中，而在水產(chǎn)育種方面報道較少。束婧婷（2007）統(tǒng)計不同品種雞（Gallus domesticus）ADSL和ARS-AIRS-GART基因的多態(tài)性，并分析不同基因型組合對胸肌IMP（肌苷酸）含量的影響，結(jié)果表明，TTTT組合基因型個體的IMP含量顯著高于CCCC型個體（P<0.05）。陳磊（2013）研究了大黑口鱸（Micropterus salmoide）8個分子標(biāo)記的基因聚合效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)隨著優(yōu)異基因型數(shù)量的增加，平均體重同步遞增，而位于MSTN上的優(yōu)異基因型對體重的貢獻(xiàn)率最大?；蛐偷木酆闲?yīng)并不是各基因型效應(yīng)所造成的表型的簡單相加，而且純合基因型互相組合具有顯著的累加效應(yīng)，能夠穩(wěn)定的遺傳給子代。在本研究中，g.3154A>G位點(diǎn)和g.4379A>G位點(diǎn)并不存在交互作用，GGGG型個體在軟體部重和閉殼肌重具有最大均值，但較其它基因型組合差異并不顯著，因而這兩個優(yōu)異基因型不存在明顯聚合效應(yīng)。

雖然未檢測到聚合效應(yīng)，但在本研究中篩選到的顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)仍可作為馬氏珠母貝基因型選擇育種的潛在分子標(biāo)記，這些標(biāo)記的育種效應(yīng)將在后續(xù)的研究中加以驗(yàn)證。

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（本文編輯：袁澤軼）

Singlenucleotide polym orphism sofm yostatin geneand itsassociation w ith grow th traits in the pearloyster,Pinctada fucata

HUANG W en1,2,LIQin1,2,LIN Jian-shi1,HE Mao-xian1
（1.CASKey LaboratoryofTropicalMarine Bio-resourcesand Ecology,Guangdong ProvincialKey LaboratoryofApplied Marine Biology,South China Sea InstituteofOceanology,Chinese AcademyofSciences,Guangzhou 510301,China;2.UniversityofChineseAcademyof Sciences,Beijing100049,China）

Abstract：Myostatin (MSTN),known as themostpowerfulgrowth differentiation factor,playsa crucial role in the negative regulation ofmuscle growth and development.The existence ofa single genewith such amajor effecton themuscle growth makes ithave the potentialvalue in the genetic improvementofanimals.In thisstudy,we used 21 eSNPs from myostatin gene to divide the genotypes of 106 individuals from a breeding stock of pearl oyster Pinctada fucata and made the correlation analysiswith the eightgrowth traits.The results show that theminorallele frequency (MAF) and polymorphism information content(PIC) are in the range of0.028 3 to 0.490 4 and 0.093 6 to 0.375 0,and the observed and expected heterozygosities range from 0.028 3 to 1.000 and 0.098 9 to 0.502 7,respectively.Two SNPsare significantly associated with growth traits:for the g.3154A>G site,individualswith GG type are significantly greater than thosewith AG type in the shellheight,shell length,totalweight,shellweight,soft tissueweightand adductormuscleweight(P<0.05);for the g.4379A>G site,oneswith GG type are significantly greater than thosewith AG type in the shellheight,shell length,hinge line length,totalweight,soft tissue weight and adductormuscle weight(P<0.05) .There is no significant interaction between g.3154A>G site and g.book=89,ebook=924379A>G site.These two SNPs could be used as the potentialmolecularmarkers in the genotype-selective breeding for P.fucata.

Keywords：Pinctada fucata;myostatin;single-nucleotide polymorphism;growth traits;association analysis

通訊作者：何毛賢，研究員，電子郵箱：hmx@scsio.ac.cn。

作者簡介：黃文，男，碩士研究生，主要從事馬氏珠母貝分子遺傳育種研究，電子郵箱：94214460@qq.com。

基金項目：國家863計劃（2012AA10A410）；廣東省科技計劃項目（2013B020308005）。

收稿日期：2015-01-30；

修訂日期：2015-03-19

Doi：10.11840/j.issn.1001-6392.2016.01.012

中圖分類號：S968.31

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-6932（2016）01-0088-08