馮偉旭

哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠 150000

探析三七中三七素及其異構(gòu)體的高效液相色譜檢測(cè)

馮偉旭

哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠 150000

目的：采用 2，4-二硝基氟苯為柱前衍生試劑，建立測(cè)定三七中三七素(β-ODAP)及其異構(gòu)體(α-ODAP)的柱前衍生反相高效液相色譜法。方法：采用Luna-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈∶HAc-NaAc(17∶83)；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量 20μL。結(jié)果：三七素(β-ODAP)色譜峰的峰面積與其濃度在 0.30～50.50μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A1=140.50C1+72.30，r1=0.9995；三七素構(gòu)體(α-ODAP)色譜峰的峰面積與其濃度在0.10～16.15μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為 A2=106.60C2+56.00，r2=0.9992。結(jié)論：不同三七樣品中均存在檢出的三七素(β-ODAP)及其異構(gòu)體(α-ODAP)。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，選擇性好，可用于植物、藥物及食品中三七素及其異構(gòu)體含量的測(cè)定。

三七素；2，4-二硝基氟苯；柱前衍生；HPLC

在對(duì)我國(guó)中藥三七進(jìn)行深入研究中，發(fā)現(xiàn)其自身具備止血治療效果的主要成分在于三七素，這種成分的在化學(xué)上是一種非蛋白游離氨基酸。也就是說三七素這種氨基酸并不能組成人體需要的蛋白質(zhì)。盡管這種物質(zhì)叫做你三七素，但是并不代表這種物質(zhì)只存在于三七這種中草藥中，在醫(yī)學(xué)實(shí)踐研究中，發(fā)現(xiàn)人參、豬屎豆和蘇鐵等草藥中也含有三七素的成分。另外在對(duì)三七素進(jìn)行深入研究中，發(fā)現(xiàn)其在對(duì)患者進(jìn)行止血治療的過程中還存在一定毒副作用。以下就針對(duì)于三七素自身毒副作用和臨床藥效進(jìn)行深入研究。

一、儀器與材料

（一）儀器

高效液相色譜儀(Agilent1100)；Luna-C18色譜柱(250mm× 4.6mm，5μm)。

（二）材料

ODAP對(duì)照品(蘭州大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室分離提純，于NaHCO3溶液中保存)；2，4二硝基氟苯(分析純，某市生工生物，乙腈配成10.0mg/mL的溶液)；磷酸鹽緩沖溶液(pH6.9)；HAc-NaAc緩沖溶液(pH4.5)；乙腈(色譜純，某市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用三七幼苗為采自云南文山生長(zhǎng) 15d的三七幼苗(本實(shí)驗(yàn)室蛭石萌發(fā)后用文山當(dāng)?shù)赝寥酪圃?，實(shí)驗(yàn)用三七塊根、須根購(gòu)自云南文山，經(jīng)天水師范學(xué)院王廷璞教授鑒定為五加科植物三七的幼苗、塊根與須根。

二、方法與結(jié)果

（一）色譜條件

色譜柱：Luna-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈∶HAc-NaAc緩沖溶液(17∶83)；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

（二）三七素的衍生化反應(yīng)

準(zhǔn)確吸取一定量ODAP對(duì)照品儲(chǔ)備液(NaHCO3溶液配置)，加入一定體積的FDNB溶液(15倍質(zhì)量比于三七素)，于60℃恒溫水浴鍋中衍生反應(yīng)30min，取出，冷卻至室溫，用移液器準(zhǔn)確移取一定體積的對(duì)照品衍生溶液，以磷酸鹽緩沖溶液定容至1mL，配制0.40～1.2×103μg/mL9個(gè)系列對(duì)照品溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后待用。

（三）三七樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取三七幼苗的不同新鮮組織(葉、莖、根)、干燥塊根粉和須根粉各1g(每個(gè)樣品平行3份)，置于-20℃冰箱冷凍保存，用事先在-20℃冰箱中冷凍過的研缽進(jìn)行研磨。準(zhǔn)確加入30%乙醇7mL作為抽提液，研至勻漿后，靜置3min，取上清液1.50mL置離心管中于-4℃下冷凍離心15min(15000r/min)，精密移取1mL上清液置于離心管中，于60℃恒溫真空干燥，待樣品完全烘干后，向樣品中加入100μLNaHCO3溶液，充分震蕩，使其溶解，再加入100μLFDNB溶液，于60℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行衍生反應(yīng)，30min后取出，冷卻至室溫，加入 800μL磷酸鹽緩沖溶液，以0.5mol/LNaHCO3溶液定容至1mL，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液進(jìn)行測(cè)定。

（四）線性范圍和回歸方程

在選定的色譜條件下，β-ODAP色譜峰的峰面積與其濃度在 0.30～50.50μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A1=140.50C1+72.30，r1=0.9995；α-ODAP色譜峰的峰面積與其濃度在 0.10～16.15μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A2=106.60C2+56.00，r2=0.9992。

（五）穩(wěn)定性試驗(yàn)

將三七塊根樣品的衍生溶液置于室溫保存，分別于衍生結(jié)束后的 0、2、4、6、8、12、16、20、24h進(jìn)行測(cè)定，吸收峰面積的RSD為1.3%，表明樣品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定。將75.00μg/mLODAP對(duì)照品的衍生溶液置室溫下放置7d后進(jìn)行液相色譜測(cè)定，吸收峰峰面積與衍生剛結(jié)束無顯著性差異。

（六）精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對(duì)75.00μg/mLODAP對(duì)照品衍生溶液連續(xù)測(cè)量11次，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%；平均加樣回收率為98.8%。

（七）樣品測(cè)定

在選定的色譜條件下，對(duì)不同三七樣品中的β-ODAP和α -ODAP進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 不同三七樣品中β-ODAP和α-ODAP的含量(%，n=3)

三、討論

要想保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程能夠全部落實(shí)，還需要保證在實(shí)驗(yàn)過程中采取的實(shí)驗(yàn)試劑能夠符合三七素自身結(jié)構(gòu)狀態(tài)。在這個(gè)過程中還需要保證三七素分離度能夠達(dá)到相應(yīng)要求。但是在實(shí)驗(yàn)研究中了解到采用β-ODAP和α-ODAP這兩種分離液進(jìn)行三七素分離過程還存在一定偏差，這就需要采用Gaussian09方法來計(jì)算這兩者之間的異構(gòu)體模式，并選取在不同衍生劑條件下的最低能量結(jié)構(gòu)。在整個(gè)色譜柱分析過程中了解到采用β-ODAP和α -ODAP這兩種分離劑進(jìn)行分離得到的三七素在結(jié)構(gòu)上還存在很大的差異，而且這種差異還會(huì)因?yàn)槠湓谔贾贤Ａ舻臅r(shí)間發(fā)生正向比例變化，也就是說在碳柱上停留的時(shí)間越長(zhǎng)就會(huì)導(dǎo)致這兩者之間的差異越大，加大了三七素分離的難度。

另外在整個(gè)過程中三七素和相應(yīng)試劑所處的條件也會(huì)影響三七素自身衍生效果。一般來說在進(jìn)行三七素衍生結(jié)果分析的時(shí)候應(yīng)該保持衍生溫度在30℃-60℃之間，這是因?yàn)樵诔^ 60℃的條件下會(huì)導(dǎo)致整個(gè)三七素衍生過程中的衍生物質(zhì)明顯降低，其根本原因在于這個(gè)時(shí)間段內(nèi)三七素自身狀況還沒有達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)下，很容易發(fā)生水解現(xiàn)象。在將發(fā)生水解之后的三七素移至常溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，發(fā)現(xiàn)衍生產(chǎn)物自身吸收峰的面積沒有太大的變化，這就說明在三七素在常溫下的穩(wěn)定性是最強(qiáng)的。在對(duì)不同的衍生條件進(jìn)行研究中了解到在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中采取不同的衍生條件對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生一定影響。因此在進(jìn)行衍生條件選取的時(shí)候，需要對(duì)整個(gè)三七素的結(jié)構(gòu)成分有一個(gè)全面了解，促使整個(gè)衍生實(shí)驗(yàn)更加順利的進(jìn)行。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中還需要對(duì)色譜條件進(jìn)行合理優(yōu)化，在使用乙腈-醋酸鹽緩沖溶液的時(shí)候會(huì)使得整個(gè)溶液狀態(tài)發(fā)生嚴(yán)重變化，形成色譜差，造成進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的溶劑瓶自身發(fā)生非常嚴(yán)重的堵塞現(xiàn)象，針對(duì)于這種情況就需要采用乙腈與HAc-NaAc緩沖液結(jié)合的方式進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，保證數(shù)據(jù)的真實(shí)性和有效性。

在上述實(shí)驗(yàn)中了解到在不同三七樣品中都有三七素的存在，但是這些三七素在結(jié)構(gòu)上還存在一定差異。而且現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)研究方法還存在很大不足，針對(duì)于這種情況就需要在進(jìn)行三七素研究中對(duì)方法中的不足提出有效解決措施。在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中還需要按照三七素的相應(yīng)物質(zhì)成分選取有效的緩沖溶液對(duì)三七素這種物質(zhì)進(jìn)行緩沖，保證其自身反向柱相容性能夠符合相應(yīng)規(guī)定。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中采用的乙腈-醋酸鹽溶液對(duì)于延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)色譜柱的使用壽命期到非常重要的作用。另外為了保證三七素分析數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性有一定提升，還需要對(duì)整個(gè)過程中使用的乙腈-醋酸鹽濃度和可溶性有一個(gè)全面考慮，保證其自身狀態(tài)能夠全面符合整個(gè)實(shí)驗(yàn)的需求。一般來說對(duì)乙腈-醋酸鹽的比例應(yīng)該保持其能夠在10分鐘內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣，這樣對(duì)于減少三七素分析時(shí)間，提高分析效率起到非常重要的作用。

[1]周桂友，侯艷芳，董新吉.柱前衍生-反相高效液相色譜法測(cè)定氨基酸[J]．理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè))，2011，47(8):889-893.

[2]常艷.新藥生殖發(fā)育毒性評(píng)價(jià)及胚胎毒性體外篩檢方法的建立和應(yīng)用[D]．上海:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，2005.

[3]張勇.三七素臨床前藥物動(dòng)力學(xué)和雷貝拉唑制劑生物等效性研究[D]．沈陽:沈陽藥科大學(xué)，2006.

R284.1

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1672-5018（2016）10-007-02