邱順華,金李芬

(自貢市第三人民醫(yī)院，四川自貢 643020)

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·臨床研究·

SLAN-96P型熒光定量PCR儀性能評價及其應(yīng)用

邱順華,金李芬

(自貢市第三人民醫(yī)院，四川自貢 643020)

摘要:目的評價SLAN-96P型熒光定量PCR儀(SLAN-96P)的主要性能指標及其應(yīng)用價值。方法按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI) 文件制定的評價標準，對40份臨床血清標本、質(zhì)控品和標準品進行乙型肝炎病毒DNA (HBV-DNA)定量檢測，評價該儀器的準確性、重復(fù)性、線性、靈敏度、A模塊與B模塊的可比性等指標。結(jié)果準確度的相對偏倚為0.2%～5.2%；重復(fù)性：批內(nèi)變異系數(shù)(CV(批內(nèi)))為1.37%～2.75%，批間變異系數(shù)(CV(批間))為1.52%～2.51%；靈敏度：SLAN-96P能檢測的最低HBV-DNA濃度為102 IU/mL；線性：直線回歸方程是Y=0.982X+0.094 8，相關(guān)系數(shù)(r)=0.999；A模塊與B模塊的可比性：A模塊與B模塊的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，直線回歸方程為Y=1.000 7X+0.012 4，r=0.994。結(jié)論SLAN-96P型熒光定量PCR儀各項性能指標良好，SLAN-96P在病原微生物核酸檢測方面具有高效、靈敏、快捷、定量的特點，具有很好的臨床應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞:SLAN-96P型熒光定量PCR儀；性能評價；乙型肝炎病毒DNA

PCR技術(shù)作為一項“革命性的技術(shù)”，不僅推動了遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展，而且在其他生命科學(xué)領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用。熒光定量PCR技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便的優(yōu)點，在臨床病毒診斷中具有巨大的應(yīng)用價值。乙型肝炎病毒DNA (HBV-DNA)的檢測有助于診斷病毒的感染情況，動態(tài)監(jiān)測肝炎病毒的復(fù)制情況，動態(tài)觀察用藥后抗病毒的效果。特別是那些慢性乙型肝炎患者乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性，但仍然伴有高水平的HBV復(fù)制，檢測HBV-DNA可以判定病毒復(fù)制情況[1-2]。臨床治療過程中，患者血清中HBV-DNA載量下降2個Log值，說明治療有效，而患者用藥3個月后病毒載量沒有下降，表示治療無效[3-4]。因此，測定結(jié)果的準確對臨床診斷、治療及療效觀察尤為重要。熒光定量PCR儀是美國ABI公司于1996年首次開發(fā)出來。目前我國也開發(fā)出許多品牌的熒光定量PCR儀，SLAN-96P型熒光定量PCR儀是由上海宏石有限公司開發(fā)出來。為了驗證其PCR檢測結(jié)果準確性，筆者對自貢市第三人民醫(yī)院引進的SLAN-96P型熒光定量PCR儀進行主要性能指標的評價試驗，分析儀器的性能特性，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1一般資料臨床標本來源于自貢市第三人民醫(yī)院門診和住院患者，收集40例符合要求且經(jīng)本院SLAN-96P熒光定量PCR儀檢測HBV-DNA的不溶血、不脂血患者血清標本，分裝于1.5 mL離心管內(nèi)，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2儀器與試劑主要儀器：SLAN-96P型實時熒光定量PCR儀(上海宏石有限公司)、生物安全柜、離心機等。試劑：HBV-DNA定量檢測試劑盒及HBV-DNA標準品均由湖南圣湘生物科技有限公司提供。質(zhì)控品血清：由衛(wèi)生部臨檢中心提供的HBV-DNA質(zhì)控品。

1.3方法

1.3.1準確度驗證試驗以衛(wèi)生部室間評價結(jié)果靶值為真值，靶值±0.4Log為允許范圍，計算測定結(jié)果與真值之間的偏倚。偏倚=(測定值-真值)/真值×100%。

1.3.2重復(fù)性試驗按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)評價標準，在SLAN-96P熒光定量PCR儀器上檢測106、105、104IU/mL 3個濃度的HBV-DNA。批內(nèi)重復(fù)性試驗在相同條件下對同一標本在一天內(nèi)測定20次；批間重復(fù)性試驗每天各測定1次，連續(xù)測定20 d，分別計算出批內(nèi)和批間的平均值、標準差和變異系數(shù)。

1.3.3靈敏度試驗用質(zhì)控血清稀釋至103、102、10 IU/mL 3個水平濃度，在SLAN-P6P熒光定量PCR儀重復(fù)測定10次，根據(jù)其陽性檢出率判斷其靈敏度。

1.3.4線性測定分別取4×107、4×106、4×105、4×104IU/mL的標準品，在SLAN-P6P熒光定量PCR儀測定1次，將檢測值和預(yù)測值做直線相關(guān)分析。

1.3.5A模塊與B模塊比對試驗選取40份HBV-DNA陽性的臨床血清標本，濃度為103～108IU/mL。在SLAN-P6P熒光定量PCR儀的A模塊和B模塊平行測定HBV-DNA，每天檢測8個標本，連續(xù)檢測5 d，計算A模塊與B模塊結(jié)果的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)都經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后采用EXCEL2003進行統(tǒng)計分析。SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行直線相關(guān)分析及配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1SLAN-96P 準確度通過表1可知，1411、1412、1414標本為陽性，測定結(jié)果的偏倚分別為5.2%、0.2%、3.2%，3個陽性標本準確度評價良好，均符合衛(wèi)生部要求。1413和1415為陰性，測定結(jié)果也為陰性。

表1 HBV-DNA衛(wèi)生部評價標本測定結(jié)果及偏倚

2.2重復(fù)性結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)(CV批內(nèi))為1.37%～2.75%，批間變異系數(shù)(CV批間)為1.52%～2.51%，3種濃度的HBV-DNA在SLAN-96P熒光定量PCR儀上檢測的CV批內(nèi)和CV批間均符合衛(wèi)生部標準，見表2。

表2　　SLAN-96P 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.3靈敏度分析103IU/mL濃度的HBV-DNA病毒血清在SLAN-96P熒光定量PCR儀上擴增分析，具有明顯的擴增曲線，檢出率為100%；102IU/mL濃度的血清檢出率降至100%;10 IU/mL濃度血清檢測時無明顯的擴增曲線，檢出率僅為30%。因此，SLAN-96P熒光PCR儀能檢測的最低HBV-DNA濃度水平為102IU/mL。

2.4線性測定結(jié)果將4個濃度梯度的HBV-DNA標準品在SLAN-96P上檢測分析得到：直線回歸方程Y=0.982X+0.094 8，相關(guān)系數(shù)(r)=0.999。

2.5A模塊與B模塊比對試驗結(jié)果A模塊與B模塊的兩組檢測結(jié)果進行配對t檢驗，P=0.515，提示A模塊與B模塊的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；A模塊與B模塊的直線回歸方程及相關(guān)系數(shù)：Y=1.000 7X+0.012 4，r=0.994。

3討論

目前，熒光定量PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床，可以檢測多種病原微生物。熒光定量PCR技術(shù)融匯了PCR 技術(shù)的核酸高效擴增，光譜技術(shù)的高敏感性，探針技術(shù)的高特異性和高精確定量的優(yōu)點，直接監(jiān)測PCR過程中熒光信號的變化以獲得準確的結(jié)果，可以彌補定性PCR的不足[5]。SLAN-96P型熒光定量PCR儀使用LED燈作為光源，實現(xiàn)永久的光源壽命[6-8]；采用了半導(dǎo)體導(dǎo)熱系統(tǒng)，每個反應(yīng)孔均有獨立的溫控監(jiān)測點和高效的散熱系統(tǒng)，確保均一的反應(yīng)孔溫度，無邊緣效應(yīng)[9-10]；設(shè)立了兩個獨立的反應(yīng)模塊A/B，一臺熒光PCR儀可以作為兩臺普通的熒光PCR儀來用。

HBV-DNA定量檢測可以定量反映乙肝患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況，是檢測乙肝病毒的最可靠方法，對臨床抗病毒治療的療效觀察及指導(dǎo)臨床用藥具有重要價值。目前，熒光定量PCR技術(shù)檢測HBV-DNA是HBV檢測的“金標準”，已廣泛應(yīng)用于臨床，為急、慢性乙型肝炎患者的診治、療效的觀察及預(yù)后的判定提供了可靠依據(jù)[11-13]。

SLAN-96P準確度試驗表明：5個衛(wèi)生部質(zhì)控標本均符合衛(wèi)生部要求，其中1411、1412、1414這3個陽性標本測定結(jié)果的偏差分別為5.2%、0.2%、3.2%，均小于ISO15189要求的7.5%。重復(fù)性試驗結(jié)果表明：104、105、106IU/mL 3個數(shù)量級水平濃度的CV批內(nèi)和CV批間值均小于5%，具有良好的重復(fù)性。靈敏度試驗表明：SLAN-96P在HBV-DNA濃度為103和102IU/mL時檢出率均高達100%，具有較高的靈敏度，提示在一定程度上可以降低假陰性率，提高檢出率；10 IU/mL時檢出率較低，可能原因是吸樣隨機誤差造成的檢出率低。線性試驗表明：4個梯度濃度的標準品，檢測得到的r為0.999，大于廠家要求的0.98，為HBV-DNA定量提供參照標準，保證定量結(jié)果準確。SLAN-96P儀器的A模塊與B模塊比對試驗表明：A模塊與B模塊的檢測結(jié)果r為0.994，相關(guān)性很好；配對t檢驗結(jié)果為P=0.515>0.05，提示SLAN-96P儀器的A模塊與B模塊的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均能檢測臨床標本[9-13]。

綜上所述，SLAN-96P型熒光定量PCR儀的準確度、重復(fù)性及靈敏度均達到衛(wèi)生部的要求，線性范圍較寬，為臨床病原微生物的檢測提供一個良好的檢測系統(tǒng)，可滿足臨床檢測的需要。

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(收稿日期：2015-12-16)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.036

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0801-03