楊　莉，何浩明

(1.沭陽縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷 223600；2.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222002)

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·臨床研究·

急性髓細(xì)胞白血病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢驗(yàn)分析

楊莉1，何浩明2

(1.沭陽縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷 223600；2.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222002)

摘要:目的應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測急性髓細(xì)胞白血病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化分析，揭示急性髓細(xì)胞白血病中外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化規(guī)律，為臨床個(gè)體化治療累積分子機(jī)制研究資料。方法應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測80例急性髓細(xì)胞白血病患者外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用相應(yīng)的單克隆抗體檢測CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值及CD16+/CD56+NK細(xì)胞百分比。同時(shí)通過CD45/SSC設(shè)門分析，分別測定多種CD分子的表達(dá)率，并通過配對檢驗(yàn)分析不同高表達(dá)CD分子相關(guān)性。結(jié)果急性髓細(xì)胞白血病(AML)組患者CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值及CD16+/CD56+NK細(xì)胞百分比顯著低于健康對照組，CD33、CD15、Cyt-MPO和CD64陽性表達(dá)不僅比例高，而且表達(dá)量高。配對分析表明CD33/CD15和CD33/Cyt-MPO的抗原表達(dá)有差異性。結(jié)論AML患者免疫系統(tǒng)低下，外周血CD33、CD15、CD64和Cyt-MPO的表達(dá)高。

關(guān)鍵詞:急性髓細(xì)胞白血??；淋巴細(xì)胞亞型；CD抗原

急性髓細(xì)胞白血病(AML)也稱為急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)，是一種血細(xì)胞的髓性癌積聚在骨髓中生長快速的異常白細(xì)胞干擾正常血細(xì)胞的生成，進(jìn)而從骨髓進(jìn)入血液取代正常血細(xì)胞，是高度異質(zhì)化的惡性血液病。AML疾病的進(jìn)展十分迅速，患者如若診斷不及時(shí)或未接受治療通常幾周或幾個(gè)月的時(shí)間就可能丟失生命[1]。AML的具體病因至今并不明確，病毒感染、遺傳因素、化學(xué)物質(zhì)毒性等都可能與AML的發(fā)病有關(guān)，而機(jī)體細(xì)胞/體液免疫功能缺失，免疫監(jiān)視和免疫清除能力減弱，可能會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞無限增殖[2-3]。因此通過檢測AML患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分析，可判斷患者機(jī)體免疫功能狀態(tài)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)重建的情況，采取相應(yīng)的措施預(yù)防感染。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年6月至2015年6月江蘇省沭陽縣人民醫(yī)院收治的80例AML患者的標(biāo)本，根據(jù)臨床血常規(guī)和骨髓穿刺檢查確診，符合張之南的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]。80例患者(AML組)中男45例，女35例；年齡4～62歲，中位年齡19歲；根據(jù)FAB分型劃分為M0 2例，M1 10例，M2 26例，M3 21例，M4 6例，M5 8例，M6 7例。選取同期健康者80例(健康對照組)，其中男48例，女32例，年齡16～54歲、中位年齡22歲。兩組研究對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2試劑和儀器MultiSET免洗淋巴細(xì)胞亞群試劑盒，紅細(xì)胞裂解液，以及CD4、CD8、CD56、CD16、CD19、CD7、CD2和CD64等單克隆抗體購自美國BD公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3方法采取外周靜脈全血2 mL置于抗凝管中振搖均勻后備用。分別取50 μL抗凝全血置于FACS專用試管中，各加入20 μL CD3/CD4/CD8/CD45/CD19/CD45/CD1等標(biāo)記的抗體，漩渦混勻，室溫避光放置15 min后，加入450 μL溶血素，混勻后避光放置15 min，通過流式細(xì)胞儀CD45/SSC設(shè)門對10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測，通過FACS Diva軟件分析細(xì)胞的免疫表型和表達(dá)強(qiáng)度。

2結(jié)果

2.1淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果AML組與健康對照組比較，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+均明顯低于健康對照組(P<0.05)；CD19+B淋巴細(xì)胞百分比AML組明顯高于健康對照組(P<0.05)；而AML組CD16+/CD56+NK細(xì)胞百分比明顯低于健康對照組(P<0.05)。見表1。

2.2不同CD分子在AML患者中的表達(dá)80例AML患者中CD抗原表達(dá)各不相同，其中以Cyt-MPO、CD38、CD33和CD64表達(dá)率較高(表2)，將表達(dá)百分比超過60.0%作為高表達(dá)患者，則Cyt-MPO(68.8%)、CD38(71.2%)、CD64(32.5%)和CD33(73.8%)為高陽性表達(dá)，提示這些CD分子在AML診斷上可能有直接診斷價(jià)值。

表1　　AML患者及健康對照組外周血T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞亞群檢測結(jié)果±s)

*1:P<0.05,與健康對照組相比。

表2　　80例AML患者CD抗原表達(dá)分布[n=80，n(%)]

2.3高表達(dá)CD33與CD15、CD64和Cyt-MPO在AML患者體內(nèi)表達(dá)的相關(guān)性由表2的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)CD33、CD15、CD64和Cyt-MPO在AML患者中的表達(dá)程度較高(將表達(dá)率超過60.0%定義為陽性)，分別進(jìn)行CD33與CD15、CD64及Cyt-MPO的兩兩比較，經(jīng)檢驗(yàn)CD33與CD15、Cyt-MPO的抗原表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD33與CD64之間的抗原表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　　高表達(dá)CD33與CD15、CD64和Cyt-MPO在

3討論

AML是造血干細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤性疾病，雖然白血病的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是目前AML患者的5年生存率依然較低[5]。主要是目前的治療手段不能夠徹底清除致病細(xì)胞，使得致病細(xì)胞有一定的殘留，從而引起白血病復(fù)發(fā)，這是導(dǎo)致白血病致死的關(guān)鍵因素[6-7]。

臨床很多研究資料的結(jié)果表明，白血病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群異常與白血病的發(fā)病具有較為密切的相關(guān)性。淋巴細(xì)胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的表面標(biāo)志與功能，可將淋巴細(xì)胞分成許多不同的群體，在免疫應(yīng)答過程中經(jīng)抗原活化后進(jìn)行分化和增殖，最后表達(dá)功能行使效應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中起中心調(diào)控作用。T細(xì)胞亞群是一群具有特殊標(biāo)志的人胸腺中輸出細(xì)胞，執(zhí)行細(xì)胞免疫功能及免疫調(diào)節(jié)功能；其中 CD3+細(xì)胞代表 T 淋巴細(xì)胞總數(shù)；CD4+細(xì)胞為免疫應(yīng)答中的主要反應(yīng)細(xì)胞，具有增強(qiáng)和擴(kuò)大其他免疫細(xì)胞的功能；CD8+細(xì)胞可對靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，同時(shí)對 CD4+細(xì)胞具有調(diào)節(jié)性免疫抑制作用；CD4+/CD8+的穩(wěn)定比例維持著細(xì)胞免疫反應(yīng)的平衡，只有在 CD4+/CD8+正常時(shí)才能發(fā)揮抗腫瘤作用。CD4+T淋巴細(xì)胞的減少表明患者體內(nèi)細(xì)胞免疫功能下降；CD8+T淋巴細(xì)胞的相對增加使得機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，減弱白細(xì)胞清除癌變細(xì)胞的能力，使癌變細(xì)胞殘存，導(dǎo)致復(fù)發(fā)率上升。CD19是B細(xì)胞的標(biāo)志之一，與B細(xì)胞的分化、活化、增殖以及抗體產(chǎn)生有關(guān)。由于CD45是白細(xì)胞表面的共同抗原，通過CD45/SSC設(shè)門可以得到幾乎沒有雜細(xì)胞的全部白細(xì)胞。CD33分子是髓系細(xì)胞細(xì)胞表面的跨膜受體，通常被認(rèn)為是粒細(xì)胞特異性的標(biāo)志[8]。CD64分布于白細(xì)胞表面，是Fc受體之一，屬于免疫球蛋白超家族的成員，是連接體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞免疫的橋梁作用[9]。Cyt-MPO是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒產(chǎn)生的一種重要的過氧化物酶，可以通過催化氯化物和過氧化氫的氧化產(chǎn)生足夠的自由基，抑制NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)，可以直接影響機(jī)體的免疫功能[10]。CD15是一種存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞細(xì)胞膜表面糖蛋白的一種碳水化合物抗原。CD15不僅作為第二信使參與細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，將細(xì)胞外信息傳導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，而且還通過細(xì)胞黏附作用，使腫瘤細(xì)胞易于黏附在基膜上，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。

本文對AML患者和健康人的外周血淋巴細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，AML患者的CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值均明顯低于健康人，CD8+T淋巴細(xì)胞高于健康人，說明AML患者體內(nèi)的免疫功能紊亂。結(jié)果還顯示AML患者體內(nèi)的CD19水平明顯高于健康人，其原因可能是由于CD4+、CD3+T淋巴細(xì)胞的下降以及CD4+/CD8+比值的降低可以刺激B淋巴細(xì)胞增生，造成體液免疫功能亢進(jìn)而導(dǎo)致的[7]。CD16+/CD56+是NK細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)量可能與NK細(xì)胞的功能有關(guān)。NK細(xì)胞是機(jī)體防御的天然平展，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞或使其活性降低抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。AML患者NK細(xì)胞百分比顯著降低，說明初發(fā)AML患者NK細(xì)胞功能低下，機(jī)體免疫能力下降。

本研究進(jìn)一步檢測了多種CD分子，結(jié)果表明不同CD分子在同一個(gè)體的表達(dá)差異較大。CD33、CD15、Cyt-MPO和CD64陽性表達(dá)不僅比例高，而且表達(dá)量高，具有足夠的穩(wěn)定性，在AML的診斷中有著重要的意義。本研究通過配對檢驗(yàn)分別比對CD33/CD15、CD33/CD64和CD33/MPO高表達(dá)的構(gòu)成差異，結(jié)果顯示CD33/CD15和CD33/Cyt-MPO的抗原表達(dá)有差異性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明兩者聯(lián)合檢驗(yàn)會(huì)提高AML的診斷率。

綜上所述，AML患者免疫功能低下，CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)顯著降低，在多種CD分子的檢測中，同一個(gè)對不同CD分子的表達(dá)也不相同。CD13、CD33、Cyt-MPO和CD64在AML中有著更高的陽性表達(dá)率。隨著嵌合抗原受體T細(xì)胞、NK細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，靶向性更強(qiáng)的治療手段會(huì)為徹底治愈AML提供思路。

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(收稿日期：2016-01-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.045

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0817-03