趙　明，馮　婧，劉　勇，楊玲麟

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州 646000)

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·論著·

TIGAR調節(jié)肺癌細胞的增殖和侵襲能力研究

趙明，馮婧，劉勇，楊玲麟△

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州 646000)

摘要:目的探討P53下游基因TIGAR在肺癌細胞A549增殖、遷移及侵襲中的作用。方法采用siRNA技術在A549細胞中干擾TIGAR的表達，細胞計數(shù)試劑盒 ( CCK-8)檢測細胞增殖，小室法檢測細胞遷移，腫瘤細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲，免疫印跡雜交檢測相關蛋白水平變化。結果在A549細胞中成功干擾TIGAR后，細胞增殖顯著降低(P<0.05)，細胞遷移和侵襲能力顯著減弱，侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達量均下調。結論TIGAR促進肺癌細胞A549的增殖，并促進細胞的遷移和侵襲能力。

關鍵詞:TIGAR；A549；增殖；遷移；侵襲

TIGAR是 2006 年發(fā)現(xiàn)的p53下游的一個直接靶基因[1]，在許多腫瘤中均呈現(xiàn)出異常表達。在乳腺癌細胞系(MCF-7)細胞中，TIGAR通過調控細胞周期相關蛋白RB的去磷酸化來影響RB-E2F1的結合能力，從而調節(jié)細胞增殖[2]。TIGAR 的表達在腸上皮再生，小腸及結腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起著關鍵作用，在 TIGAR表達缺失的小鼠模型中腸上皮的增生能力明顯降低，小腸腺瘤的增殖能力也明顯下降[3]。因此，TIGAR 作為一個潛在的具有應用前景的腫瘤治療靶點日益受到研究者的關注。本文選取肺癌細胞A549作為研究對象，探討干擾TIGAR對肺癌細胞增殖的影響，以及細胞遷移和侵襲能力的變化。

1材料與方法

1.1細胞來源肺癌細胞A549，購買于中國科學院細胞庫。

1.2儀器與試劑蛋白電泳及轉膜裝置購買于Bio-Rad(百樂公司);lipofectimine 2000(脂質體)陽離子脂質體購買于美國Invitrogen公司;CCK-8購買于碧云天公司；transwell小室、基質膠matrigel購買于美國BD Bioscience公司；抗體TIGAR購買于英國abcam公司，MMP-2抗體、MMP-9抗體購買于武漢三鷹公司，GAPDH抗體購買于美國Cell signaling technology公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)與轉染人肺癌細胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640，培養(yǎng)條件為5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。siRNA由上海GeneChem公司合成。Si-TIGAR序列為GCC AGC TTT ACT GGA GAA CTT，Si-Control序列為TTA CCG AGA CCG TAC GTA T。細胞分兩組，按照說明書分別轉染Si-TIGAR和Si-Control，5 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2CCK-8接種細胞于96孔板，轉染48 h后加入CCK-8 10 μL于每孔，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標儀測定450 nm吸光值。

1.3.3小室法和腫瘤細胞侵襲實驗對于小室法無血清培養(yǎng)基重懸細胞至3×105/mL，接種100 μL于transwell小室上室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 h后，棉球擦去上室細胞，結晶紫染色，顯微鏡觀察拍照。對于腫瘤細胞侵襲實驗，上室需提前加入50 μL基質膠matrigel,48 h后棉球擦去上室細胞，結晶紫染色，顯微鏡觀察拍照。

1.3.4免疫印跡雜交轉染后72 h收集細胞，提取總蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，蛋白轉印至PVDF纖維素膜上后，3%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗滌后，二抗孵育1 h，洗脫液TBST洗滌后顯色試劑ECL化學發(fā)光檢測。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，組間比較使用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1干擾TIGAR效率檢測轉染Si-TIGAR和Si-Control 72 h后，免疫印跡雜交檢測干擾組TIGAR表達量顯著低于對照組，具有較高的干擾效率，見圖1。

圖1　　TIGAR表達水平

2.2干擾TIGAR后細胞增殖檢測轉染48 h后，加入CCK-8檢測增殖發(fā)現(xiàn)，干擾組細胞數(shù)量顯著低于對照組，干擾TIGAR后，細胞增殖速率降低，見圖2。

圖2　　細胞增殖檢測

2.3干擾TIGAR后細胞遷移和侵襲檢測接種后20 h，結晶紫染色遷移組細胞，觀察到干擾組細胞比對照組顯著減少，證明細胞遷移能力降低；接種后48 h，結晶紫染色侵襲組細胞，觀察到干擾組細胞比對照組顯著減少，證明細胞侵襲能力降低，見圖3。

圖3　　細胞遷移、侵襲檢測

2.4干擾TIGAR后侵襲相關蛋白檢測免疫印跡雜交檢測侵襲相關蛋白MMP-2，MMP-9表達，發(fā)現(xiàn)在干擾組中表達量顯著低于對照組，見圖4。

圖4　　MMP-2，MMP-9表達量

3討論

腫瘤的轉移是一個極其復雜的過程，首先需要突破細胞外基質(ECM)的屏障才能向周圍組織侵襲，進入循環(huán)系統(tǒng)?；|金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM最重要的蛋白酶。已有文獻報道在食管癌、胃癌、結腸癌等腫瘤中MMPs均呈現(xiàn)出過表達。因此，研究MMPs在肺癌中的表達及其調控機制具有重要意義[4-9]。

TIGAR是P53下游的靶基因，在TIGAR表達缺失的小鼠結腸腫瘤模型中，結腸腫瘤細胞轉移到肺等器官的能力降低[10-12]，證明了TIGAR在腫瘤轉移的過程中起到非常重要的作用[3]。通過此研究，發(fā)現(xiàn)通過siRNA技術干擾TIGAR可降低MMP-2、MMP-9的表達[13-14]，從而減弱肺癌細胞的遷移和侵襲能力，加深了對于肺癌轉移分子機制的認識，具有重要的指導意義。

參考文獻

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TIGAR promotes proliferation and invasiveness of lung cancer cells

ZhaoMing，F(xiàn)engJing，LiuYong，YangLinglin△

(DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the role of P53 target gene TIGAR on proliferation,migration and invasion of lung cancer cells.MethodssiRNA was introduced to knock down TIGAR in A549 cells.Proliferation was detected by CCK-8.The ability of migration and invasion was measured by and,respectively.was used to evaluate the expression levels of related proteins.ResultsKnockdown of TIGAR reduced the proliferation rate(P<0.05),inhibited the ability of migration and invasion,decreased expression levels of MMP-2 and MMP-9.ConclusionTIGAR promotes proliferation,migration and invasiveness of lung cancer cells.

Key words:TIGAR；A549；proliferation；migration；invasion

(收稿日期：2015-11-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.014

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0754-02

作者簡介：趙明，男，檢驗技師，主要從事臨床檢驗研究。(△)通訊作者，E-mail：yangllluyi@126.com。