王歡，吳瑩，黃嫣，李希,，馮建安，王佳

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HPLC-DAD同時測定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸的含量

王歡1，吳瑩1，黃嫣2，李希1,2，馮建安2，王佳1

[摘要]目的：建立HPLC-DAD同時測定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量的方法。方法：采用Spursil C(18)色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90∶10∶0.03∶0.06），流速0.5 mL．min(-1)，柱溫35℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。結(jié)果：齊墩果酸和熊果酸分別在0.0218～0.218 μg．μL(-1)(r=0.9997)和0.07312～0.7312 μg．μL(-1)(r=0.9996)范圍內(nèi)線性關系良好，平均回收率分別98.17％(RSD=1.89％)、99.31％(RSD=2.62％)。結(jié)論：HPLC-DAD能同時測定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量，并且該檢測方法簡便準確、穩(wěn)定可靠，可用于白花蛇舌草藥材的質(zhì)量控制。

[關鍵詞]白花蛇舌草；HPLC-DAD；齊墩果酸；熊果酸

[作者單位]1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 610075；2.四川省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)研究所，四川 成都610031

白花蛇舌草始載于《廣西中藥志》，為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的干燥全草[1]。本品具有清熱解毒、利濕消腫、活血止痛等功效，臨床上廣泛用于惡性腫瘤、胃腸炎、闌尾炎、泌尿系統(tǒng)感染、扁桃體炎、肺炎等[2]。白花蛇舌草主要化學成分有萜類、黃酮類、蒽醌類、苯丙素類、香豆素類、揮發(fā)油類、含酸化合物、多糖類及其他類[3]。白花蛇舌草具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗化學誘變、抗菌消炎等藥理活性作用，因此在臨床中應用廣泛，尤其在腫瘤的預防和治療中起著不可或缺的作用[4～5]。有研究報道齊墩果酸（OA）和熊果酸（UA）是其抗腫瘤的主要活性物質(zhì)。白花蛇舌草作為一種臨床治療癌癥和各種炎癥的常用中藥，2010版《中華人民共和國藥典》僅在附錄中收錄了白花蛇舌草的來源，而《四川省中藥材標準》收錄的白花蛇舌草的質(zhì)量標準也不完善，缺少含量測定的定量分析。因此對白花蛇舌草中主要活性成分OA 和UA進行定量分析，可為白花蛇舌草的質(zhì)量控制和進一步開發(fā)應用提供一定的參考依據(jù)。

OA和UA的檢測方法一般有紫外分光光度法[6]、薄層掃描法[7]和高效液相色譜法[8]。高效液相色譜法具有分析速度快，分離效能高，應用范圍廣及靈敏度高的特點。文獻中雖有報道利用高效液相色譜法測定OA和UA的含量，但二者屬于同分異構(gòu)體，分離度和峰形均不理想，并且出峰時間長。本實驗通過HPLC-DAD建立了同時測定白花蛇舌草中OA和UA的含量。該方法簡便，穩(wěn)定可行，出峰時間短，可用于白花蛇舌草的質(zhì)量控制方法。

1　儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），DAD檢測器（美國安捷倫科技有限公司），KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BT 125D型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司），艾科浦分析型AUP-2-35G-1實驗室純化水機（頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）。

白花蛇舌草藥材購自四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)由四川省第二中醫(yī)院李希教授鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）的干燥全草。齊墩果酸對照品（OA，中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206），熊果酸對照品（UA,中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-201220），甲醇（色譜純，美國Fisher公司），三乙胺（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），水為超純水（實驗室自制），其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Spursil C18色譜柱（4.6 ×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90∶10∶0.03∶0.06），流速0.5 mL．min-1，柱溫35℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取OA和UA對照品適量，用甲醇分別配制成含OA0.545 mg．mL-1，UA0.914 mg．mL-1的對照品儲備液，精密量取對照品儲備液適量制成含OA0.109 mg．mL-1，UA0.3656 mg．mL-1的對照品混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 準確稱取白花蛇舌草粉末約1.00 g，至于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL乙醇溶液，超聲提取30 min，過濾，水浴蒸干，取適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3檢測波長的選擇

精密吸取對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，于二極管陣列檢測器（DAD）下190～400 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，結(jié)果顯示在205 nm處，OA 和UA有最大吸收，但考慮到甲醇的截止波長為205 nm，對測定產(chǎn)生一定的影響。而在210 nm處，溶劑峰對OA和UA干擾小，且分離度好，故最終確定吸收波長為210 nm。

2.4方法學考察

2.4.1系統(tǒng)適應性 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果表明，在該色譜條件下，OA和UA分離度達到1.77，OA和UA的理論塔板數(shù)均大于6000，能達到檢測要求（圖1）。

圖1　白花蛇舌草HPLC圖

2.4.2線性關系考察 取對照品儲備液一定量，加甲醇稀釋成含OA0.218，0.109，0.087 2，0.065 4，0.043 6，0.021 8 mg．mL-1，UA0.731 2，0.365 6，0.292 5，0.219 3，0.146 3，0.073 12 mg．mL-1的一系列對照品混合溶液。分別精密吸取上述對照品混合溶液10 μL，依次注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以對照品質(zhì)量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，得OA和UA的回歸方程分別為：Y=144 14X－29.854(r=0.9997)，Y=11282X －72.516（r=0.9996）。結(jié)果表明，OA在0.0218～0.218 μg．μL-1范圍內(nèi)，線性關系良好。UA在0.07312～0.7312 μg．μL-1范圍內(nèi)，線性關系良好（見圖2、圖3）。

圖2　OA標準曲線

圖3　UA標準曲線

2.4.3精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下的對照品溶液10 μL，并按上述色譜條件重復進樣6次，計算OA 和UA的峰面積RSD分別為1.71％，0.87％，表明方法精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液各10 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h時按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果對照品溶液中的OA、UA峰面積的RSD分別為1.71 ％、0.87 ％，供試品溶液中的OA、UA峰面積的RSD分別為1.83 ％、1.06％，均小于2％，表明對照品和供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5重復性試驗 對同一批白花蛇舌草樣品，分別取樣6份，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項下的測定方法進行測定。結(jié)果OA和UA的平均含量分別為0.513 5 mg．g-1，2.223 8 mg．g-1，RSD分別為0.68％和0.91％，表明該方法的重復性良好。

2.4.6加樣回收率試驗 精密稱取白花蛇舌草樣品9份，每份0.3g，分別置于具塞錐形瓶中，分別按低、中、高三個水平加入OA和UA的對照品溶液，平行三份，按“2.2.2”項下方法提取，并按“2.1”項下的色譜條件進行測定，計算回收率。結(jié)果得OA的平均回收率為98.17％ ，RSD為1.89％，UA的平均回收率為99.31％，RSD為2.62％。見表1。

表1　OA、UA加樣回收率試驗

2.4.7含量測定 取5個不同產(chǎn)地的白花蛇舌草樣品，每個產(chǎn)地各2批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下的色譜條件進行測定。結(jié)果見表2。

表2　不同產(chǎn)地白花蛇舌草的含量測定結(jié)果

3　討論

本實驗中根據(jù)OA和UA易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于水的理化性質(zhì)，分別考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮對提取的影響，結(jié)果表明，甲醇、乙醇的提取率明顯高于乙酸乙酯和丙酮，考慮到原料成本以及溶劑的安全性問題，采用乙醇為提取溶劑。以乙醇為提取溶劑，分別對加熱回流，索氏提取，超聲提取進行了單因素考察。結(jié)果顯示超聲提取和回流提取明顯優(yōu)于索氏提取，但超聲提取操作簡單，省時省力，所以選擇超聲法作為白花蛇舌草中OA和UA的提取方法。

OA和UA屬于五環(huán)三萜類的一對同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)相似，僅是E環(huán)上的一個甲基的位置不同。一般的色譜條件很難將二者達到基線分離。曾嘗試不同比例的甲醇-2％醋酸，甲醇-1％醋酸，乙腈-水，甲醇-0.1％磷酸，甲醇-0.5％磷酸的流動相，OA和UA的分離度均未達到檢測要求，并且峰形不好，有的出峰時間長。在查閱相關的文獻基礎上，發(fā)現(xiàn)加入三乙胺能很好地改善峰形，并且低流速能提高二者的分離度，通過調(diào)節(jié)甲醇-水-冰乙酸-三乙胺之間的比例，最終確定流動相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90：10：0.03：0.06），流速為0.5 mL．min-1，二者分離度達到1.77，符合檢測要求。該方法重復性好，穩(wěn)定可靠，可用于白花蛇舌草藥材中OA和UA定量分析和質(zhì)量控制。

通過對5個不同產(chǎn)地白花蛇舌草中OA和UA進行含量測定后發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的白花蛇舌草含量存在明顯的差異，其中河南、江蘇產(chǎn)地中OA、UA的含量較高。因此，白花蛇舌草質(zhì)量標準的建立需要深入系統(tǒng)的研究。白花蛇舌草中化學成分復雜，指標性成分或有效成分的制備以及質(zhì)量標準尚未建立，本文以OA和UA為指標成分，對白花蛇舌草質(zhì)量標準的研究具有一定的參考價值。

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(責任編輯：李蕓霞)

Simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in Baihuasheshecao by HPLC-DAD

WANG Huan1, WU Ying1, HUANG Yan2, LI Xi1,2, FENG Jian-an2, WANG Jia1
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine sciences, Pharmacy School, Chengdu 610075, China;2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Institute of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610031, China)

[Abstract]Objective: To establish a HPLC-DAD method for simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in Baihuasheshecao.Method: The separation was performed on the Spursil C(18)column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with methanolwater-glacial acetic acid-triethylamine (90:10:0.03:0.06) as mobile phase.The detection wavelength was 210 nm.The flow rate was 0.5 mL．min(-1).The column temperature was 35℃, and the injection volume was 10 μL.Result: The linear response of oleanolic acid and ursolic acid were 0.0218～0.218 μg．μL(-1)(r=0.9997) and 0.07312～0.7312 μg．μL(-1)(r=0.9996) respectively.The average recovery of oleanolic acid and ursolic acid were 98.17％ and 99.31％, with RSD of 1.89％ and 2.62％ respectively.Conclusion: HPLC-DAD can be used to simultaneously detect oleanolic acid and ursolic acid in Baihuasheshecao.The detection method is simple, accurate, reliable and can be used for quality control of Baihuasheshecao.

[Key words]Hedyotis diffusa willd.; HPLC-DAD; oleanolic acid; ursolic acid

[收稿日期]2015-05-29

[通訊作者]李希(1969-)，女，碩士，教授，主要從事中藥新制劑、新技術(shù)、新工藝方向研究Tel:18030897734 Email:1836820767@qq.com.

[作者簡介]王歡(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事中藥新制劑、新技術(shù)、新工藝方向研究Tel:18380228305 Email:928451725@qq.com.

[基金項目]四川省省級公益性科研院所基本科研項目(14-4-422)

[中圖分類號]R 284.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-926X(2016)01-007-03