熊雯，程龍，鄭萍

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痤瘡顆粒微生物限度檢查方法的建立

熊雯，程龍，鄭萍

[摘要]目的：建立痤瘡顆粒的微生物限度檢查方法。方法：按照《中國(guó)藥典》2010年版的規(guī)定，采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查方法驗(yàn)證。結(jié)果：痤瘡顆粒對(duì)細(xì)菌的抑制作用較小，常規(guī)法驗(yàn)證對(duì)五種試驗(yàn)菌的回收率均高于70％。結(jié)論：用該法進(jìn)行微生物限度檢查，可以客觀地反映藥物中微生物的污染狀況，以達(dá)到檢測(cè)目的。

[關(guān)鍵詞]痤瘡顆粒；微生物限度檢查；方法驗(yàn)證

[作者單位]成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610041

痤瘡顆粒是以琵琶葉、桑白皮、生地、丹皮、赤芍等為主要成分的口服給藥制劑。考慮到中藥成分對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌可能存在一定的抑制作用[1～4]，常規(guī)檢查方法不能真實(shí)地反映藥品中微生物污染的情況，故應(yīng)按照《中國(guó)藥典》2010年版的要求[5]，對(duì)所采用的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)抑菌活性的消除和檢查方法的有效性。

1　材料

1.1儀器

超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）SW-CJ-2FD；生物安全柜（蘇凈集團(tuán)安泰公司）BHC-1000ⅡA/ B3；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）LRH-250；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）GHP-9270；微生物限度檢驗(yàn)儀（杭州盈天科學(xué)儀器有限公司）YT-X300

1.2菌種

大腸埃希菌[CMCC(B) 44102]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501]，白色念珠菌[CMCC(F) 98001]，黑曲霉[CMCC(F) 98003]，銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]，均為第4代，來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3培養(yǎng)基及試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液，0.1％蛋白胨水溶液均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)，聚山梨酯80由天津市美琳工貿(mào)有限公司生產(chǎn)。

1.4樣品

痤瘡顆粒（批號(hào)：131101；131201；140201）

2　方法與結(jié)果

2.1細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.1.1常規(guī)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)的方法驗(yàn)證

①菌液制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)22 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用；

②供試液制備 取本品10 g，加pH7.0的無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，混勻得1:10供試液。

③回收率測(cè)定

供試品對(duì)照組 取1:10供試液1 mL，平行制備2個(gè)平板，測(cè)定供試品本底細(xì)菌數(shù)；

菌液組 分別取上述3種試驗(yàn)菌懸液1 mL，注入平皿，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

試驗(yàn)組 取1:10供試液1 mL和大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗(yàn)菌懸液1 mL，分別注入平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板，待凝固后，35℃培養(yǎng)3天，計(jì)數(shù)；

④結(jié)果：三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)結(jié)果如下表所示

試驗(yàn)組菌回收率：(試驗(yàn)組菌數(shù)-供試品對(duì)照組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100％。

表1　常規(guī)法（1 mL/皿）驗(yàn)證細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果（CFU/皿）

表2　常規(guī)法（1 mL/皿）驗(yàn)證細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果（cfu/皿）

表3　常規(guī)法（1 mL/皿）驗(yàn)證細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果（cfu/皿）

綜合表1、2、3可以看出，本品采用常規(guī)法（1 mL/皿）檢查細(xì)菌數(shù)，在三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，供試品對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的人工染菌回收率均高于70％，因此，本品細(xì)菌計(jì)數(shù)可采用常規(guī)法（1 mL/皿）。

2.2霉菌和酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.2.1常規(guī)法測(cè)定霉菌和酵母菌數(shù)的方法驗(yàn)證

①菌液制備 取經(jīng)25℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)物，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用；

取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加5 mL含0.05％聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的紗布的無(wú)菌毛細(xì)吸管吸出胞子懸液）至無(wú)菌試管中，用含0.05％聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的孢子懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。

②供試液制備 取本品10 g，加pH7.0的無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，混勻得1:10供試液。

③回收率測(cè)定

供試品對(duì)照組 取1:10供試液1 mL，平行制備2個(gè)平板，測(cè)定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)。

菌液組 分別取上述2種試驗(yàn)菌懸液1 mL，注入平皿，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

試驗(yàn)組 取1:10供試液1 mL和白色念珠菌、黑曲霉菌懸液1ml傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板，待凝固后，25℃培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。

結(jié)果 試驗(yàn)組菌回收率：(試驗(yàn)組菌數(shù)-供試品對(duì)照組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100％。

表4　常規(guī)法驗(yàn)證霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果（cfu/皿）

從表4可以看出，本品采用常規(guī)法檢查霉菌和酵母菌數(shù)，在三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，供試品對(duì)白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率均高于70％，因此，本品霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)可采用常規(guī)法（1 mL/皿）。

2.3控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.3.1大腸埃希菌檢查方法的驗(yàn)證

①供試液制備 取本品10 g，加pH7.0的無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，混勻得1:10供試液。

②菌液制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)22 h的大腸埃希菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用；③常規(guī)法檢查大腸埃希菌

試驗(yàn)組 取1:10供試液10 mL及制備好的大腸埃希菌懸液1 mL加入到100 mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)22 h。吸取0.2 mL培養(yǎng)物接種至5 mL MUG培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)，于5 h、24 h在366 nm紫外線(xiàn)下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察顏色變化。

陽(yáng)性對(duì)照組 取制備好的大腸埃希菌菌懸液1 mL加入到100 mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其他操作同試驗(yàn)組。

供試品對(duì)照組 取1:10供試液10 mL加入到100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，其他操作同試驗(yàn)組。

陰性對(duì)照組 取10 mL pH7.0的無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入到100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，其他操作同試驗(yàn)組。

2.3.2結(jié)果

表5　大腸埃希菌檢查方法（膽鹽乳糖培養(yǎng)基：100 mL）驗(yàn)證結(jié)果

由表5可知，陰性對(duì)照組和供試品對(duì)照組中，紫外燈下觀察和靛基質(zhì)反應(yīng)均呈陰性，而試驗(yàn)組加入大腸埃希菌培養(yǎng)后，366 nm紫外下呈現(xiàn)熒光，且加入靛基質(zhì)后，液面呈玫瑰紅色，都和陽(yáng)性對(duì)照組一樣。因此，本品大腸埃希菌可采用常規(guī)法（膽鹽乳糖培養(yǎng)機(jī)100 mL）進(jìn)行檢查。

3　討論

本品可采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)以及控制菌的檢查。根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果將微生物限度檢查方法記錄如下：取本品10 g，加pH7.0的無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，搖勻得1:10供試液。細(xì)菌計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)以及控制菌均采用常規(guī)法進(jìn)行檢查，所建立方法可有效地控制痤瘡顆粒的微生物限度。

[參考文獻(xiàn)]

[1]陳佳佳,廖森泰,孫遠(yuǎn)明,等.中草藥抑菌活性成分研究進(jìn)展[J].中藥材,2011,34(8):1313.

[2]楊淑文.32種中草藥抑菌活性的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(3):1361.

[3]蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:華齡出版社: 221．

[4]潘雯,關(guān)倩明,林玲.7種具有抑菌成分中成藥的微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 28(6):623.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[s].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄 ⅪJ108.

（責(zé)任編輯：陳思敏）

Validation of microbial limit test method of Cuochuang Keli

XIONG Wen, CHENG Long, ZHEN Pin
(ChengDu Institutes for Food and Drug Control, Chengdu, 610041, China )

[Abstract]Objective: To establish a method for the microbial limit test of Cuochuang Keli.Method: According to the Chinese Pharmacopoeia 2010 edition, the routine method was performed for microbial limit test validation of Cuochuang Kei.Result: Cuochuang Keli hardly had the antimicrobial activity.The routine method was feasible for microbial limit test.Conclusion: This method applied for microbial limit test can objectively reflect the status of microbial contamination in drugs so as to meet the destination of examination.

[Key words]Cuochuang Keli; microbial limit test; validation

[收稿日期]2015-03-17

[通訊作者]鄭萍(1969-), 女, 主任藥師, 主要從事藥品質(zhì)量控制研究 Email: zhengping028@foxmail.com

[作者簡(jiǎn)介]熊雯(1978-)，女，碩士研究生，副主任藥師，主要從事藥品質(zhì)量控制研究Tel:028-85362197 Email:xiongwen613@163.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R 283.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-926X(2016)01-012-03