禹亞杰，彭騰，尚寧寧，李鴻翔

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HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地黃芪中芒柄花苷的含量

禹亞杰，彭騰，尚寧寧，李鴻翔

[摘要]目的：測(cè)定十批不同產(chǎn)地黃芪藥材中芒柄花苷的含量，用以評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的黃芪的質(zhì)量，為實(shí)際生產(chǎn)和臨床應(yīng)用黃芪藥材的選擇提供參考。方法：采用80％甲醇回流提取，反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。Diamonsil鉆石C(18)色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈：水=25：75等度洗脫；流速：1ml．min(-1)；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。結(jié)果：內(nèi)蒙古和山西產(chǎn)的黃芪中芒柄花苷的含量較甘肅與長(zhǎng)春高。結(jié)論：不同產(chǎn)地的黃芪中芒柄花苷的含量差異較大，同一產(chǎn)地黃芪中的芒柄花苷的含量也存在差異。

[關(guān)鍵詞]黃芪；芒柄花苷；HPLC；含量測(cè)定

[作者單位]成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

黃芪為常見的中草藥也是臨床常用的中藥之一。黃芪(Astragalus, AS)是豆科植物蒙古黃芪 Astragalus mem-branaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或 膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。芒柄花苷是中藥黃芪、甘草、葛根等藥材中黃酮類化合物的主要成分之一。具有促進(jìn)皮膚生長(zhǎng)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、維持血中 NO濃度等多種藥理活性。芒柄花苷還具有促進(jìn)人體腸道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌生長(zhǎng)和抑制腸球菌和腸桿菌生長(zhǎng)的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)在相同條件下測(cè)定十批不同產(chǎn)地黃芪中芒柄花苷的含量，為評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的黃芪的質(zhì)量以及臨床與生產(chǎn)用藥的篩選提供參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀（島津LC-20AT），DAD檢測(cè)器；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；BP121S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；優(yōu)普UPT系列超純水器（成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司）色譜柱：Diamonsil鉆石C18（250mm×4.6mm，5μm）

1.2試劑

色譜乙腈和甲醇（美國(guó)天地）、超純水、其他試劑均為分析純。

1.3對(duì)照品

芒柄花苷（自制，HPLC檢測(cè)純度＞98％）。

1.4藥材

黃芪（十批藥材的產(chǎn)地與購(gòu)入時(shí)間見表1），由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龍飛副教授鑒定，均符合2010年版《中國(guó)藥典》的要求。

表1　十批黃芪藥材的產(chǎn)地與購(gòu)入時(shí)間

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品制備

精密稱取芒柄花苷對(duì)照品0.00202g，甲醇定容至10ml，得濃度為0.202mg．ml-1的對(duì)照品溶液備用。

2.2色譜條件

島津LC-20AT高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器；色譜柱：Diamonsil鉆石C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈：水=25：75；流速：1ml．min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。芒柄花苷對(duì)照品與黃芪樣品的色譜圖見圖1。

圖1　黃芪樣品及對(duì)照品HPLC色譜圖

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1線性關(guān)系考察

取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品采用自動(dòng)進(jìn)樣法分別進(jìn)樣4,8,12,16,20μL，以“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定記錄峰面積。以芒柄花苷的進(jìn)樣量（μg）為自變量X，峰面積Y為因變量，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖2。芒柄花苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3E+0.6X，r=0.9999，表明進(jìn)樣量在0.802～4.04μg之間線性關(guān)系良好。

圖2　芒柄花苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2精密度考察

取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，計(jì)算芒柄花苷峰面積的RSD值為0.56％，表明精密度良好。

3.3重復(fù)性考察

取同一供試品連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算芒柄花苷的峰面積的RSD為0.63％，表明重復(fù)性良好。

3.4穩(wěn)定性考察

取同一供試品分別在0、2、4、8、16、24h進(jìn)樣10μL，計(jì)算峰面積的RSD為1.38％，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5加樣回收實(shí)驗(yàn)

取已知含量的樣品5g，按樣品含量的50％、100％、150％加入芒柄花苷對(duì)照品，每個(gè)濃度平行3份，共 9份樣品。按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品，以“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率,芒柄花苷的平均回收率分別為99.52％、100.36％、100.57％，RSD分別為2.32％、1.04％、2.66％＜3％。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。具體數(shù)據(jù)及結(jié)果見表2。

表2　加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

3.6十批黃芪樣品制備及含量測(cè)定

精密稱取各產(chǎn)地黃芪藥材粗粉3份，每份10.00g，加入250ml80％乙醇80℃回流提取兩次，每次1h，過(guò)濾減壓回收溶劑甲醇定容至10ml。用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后按“2.2”項(xiàng)下液相條件進(jìn)行測(cè)定，分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。具體結(jié)果見表3。

表3　十批黃芪中芒柄花苷含量（n=3）

4　討論

目前對(duì)不同產(chǎn)地、用藥部位、年限、品種的單味藥中黃酮類成分的分離，制備以及含量測(cè)定均有比較全面的研究[3～6]，但不同產(chǎn)地的黃芪中芒柄花苷含量測(cè)定的報(bào)道較少。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出內(nèi)蒙古和山西產(chǎn)的黃芪中的芒柄花苷的含量較高，同一產(chǎn)區(qū)內(nèi)的黃芪樣品中芒柄花苷的含量也有所差異。由于產(chǎn)地、采收加工、時(shí)間等都可能成為影響芒柄花苷含量的因素，本實(shí)驗(yàn)的取樣量較少，不能較為全面的評(píng)價(jià)黃芪藥材的質(zhì)量，僅對(duì)芒柄花苷在不同地區(qū)的黃芪中的含量分布做一個(gè)參考，對(duì)于同一產(chǎn)地不同區(qū)域以及不同采收時(shí)間的黃芪中芒柄花苷的含量還需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)HPLC-DAD測(cè)定芒柄花苷的液相條件進(jìn)行了考察，分別考察了不同比例的流動(dòng)相（甲醇-水和乙腈-水）、流速、柱溫以及檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)出峰時(shí)間、峰的對(duì)稱性以及樣品中峰的分離度等條件的綜合考慮，最終選擇了乙腈：水=25∶75；流速：1ml．min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm的液相條件。

在測(cè)定不同產(chǎn)地黃芪中芒柄花苷含量的同時(shí)，也對(duì)黃芪同科植物甘草和葛根中的芒柄花苷的含量[7～8]進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黃芪中芒柄花苷的含量在同科植物中并不是最高的，對(duì)于芒柄花苷在同科不同植物中的分布需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).《中國(guó)藥典》一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:283.

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[5]程霞,肖朝江,孫俊哲,等.長(zhǎng)小苞黃芪化學(xué)成分研究[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào),2014,02:3.

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（責(zé)任編輯：胡慧玲）

Content determination of Ononin in Huangqi from different producing areas by HPLC

YU Ya-jie, PENG Teng, SHANG Ning-ning, LI Hong-xiang
(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137,Sichuan)

[Abstract]Objective: The Ononin content in 10 batches of Huangqi from different producing areas were detected to evaluate the quality of Huangqi from different producing areas and provide reference for the selection of Huangqi in production and clinical application.Method: Ononin was extracted using 80％ methanol reflux extraction.HPLC analysis was performed to detect Ononin content.The analysis was carried out on a DiamonsilC(18)(250m×4.6mm, 5μm)column with a mobile phases (acetonitrile : water = 25:75) .The column temperature was 30℃.The flow rate was 1mL．min(-1)and the detection was set at 254nm.Result: Ononin content in Huangqi from Inner Monglia and Shanxi were higher than Gansu and Changchun.Conclusion: Difference can be found in Ononin content in Huangqi from different producing areas.And Ononin content is different in Huangqi from the same producing area.

[Key words]Huangqi; Ononin; HPLC; content determination

[收稿日期]2015-07-13

[通訊作者]彭騰，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Tel:13880376673Email:pengteng1973@sina.com

[作者簡(jiǎn)介]禹亞杰，女，碩士在讀，從事中藥有效成分物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作Email:yuyajie201307@163.com

[基金項(xiàng)目]四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目資助課題(10ZA095)；成都市科技攻關(guān)項(xiàng)目資助課題(12GGYB346SW-001)

[中圖分類號(hào)]R282.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-926X(2016)01-006-03