尚寧寧，禹亞杰，彭騰，高鵬

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金線吊烏龜多糖的含量測(cè)定

尚寧寧1，禹亞杰1，彭騰1，高鵬2

[摘要]目的：測(cè)定金線吊烏龜多糖的含量。方法：采用水提醇沉法提取、純化金線吊烏龜多糖, 以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 用硫酸-苯酚比色法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定金線吊烏龜多糖的含量。結(jié)果：金線吊烏龜精制多糖得率為2.31％，精制多糖含量為71.78％，金線吊烏龜原藥材中總多糖含量為1.66％。結(jié)論：利用硫酸-苯酚比色法測(cè)定金線吊烏龜多糖含量，簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確。

[關(guān)鍵詞]金線吊烏龜；多糖；含量測(cè)定

[作者單位]1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；2.成都煜泉綠健科技有限公司，四川 成都 610072

金線吊烏龜(Stephania cepharantha Hayata)為防己科千金藤屬植物，其塊根為民間常用草藥，稱白藥、白藥子或白大藥。味苦性寒，有清熱解毒、消腫止痛之功效[1]，常用于治療癰疽腫毒、腮腺炎、毒蛇咬傷等。目前，對(duì)金線吊烏龜多糖方面的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取、純化金線吊烏龜多糖，采用硫酸-苯酚比色法測(cè)定其多糖含量，以期為金線吊烏龜多糖的開發(fā)利用研究提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器

二級(jí)管陣列紫外分光光度計(jì)（安捷倫，G84530）；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī);FA2004N型電子天平(上海民怡儀器儀表有限公司)；DZG-6020型真空干燥箱（上海信森實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DGG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海信森實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；電爐，干燥器，稱量瓶等。

1.2藥材與試劑

金線吊烏龜購(gòu)自四川省成都市新荷花池藥材市場(chǎng)，成都中醫(yī)藥大學(xué)彭騰教授鑒定。

D-葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110833-200503）；硫酸、苯酚、丙酮、乙醚等試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照余蘭[2]等人的方法，精密稱取105℃干燥至恒重的D-葡萄糖對(duì)照品0.0034 g，至25 mL容量瓶，加蒸餾水溶解、定容，即D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為0.136 mg．mL-1。精密吸取D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL至10 mL具塞試管中，分別快速加入1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的苯酚和7.0mL濃硫酸，充分混勻，于沸水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫，用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL。另取1.0 mL的蒸餾水同上平行操作制得空白對(duì)照液。以空白對(duì)照液作參比，在紫外分光光度計(jì)上掃描，于490 nm處測(cè)吸光度值。以D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定結(jié)果見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果見圖1。得回歸方程：A= 44.136C+ 0.0395(R2= 0.9944)。

表1　標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定結(jié)果

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2多糖的提取、純化

參考文獻(xiàn)([2～6])，稱取金線吊烏龜藥材100.08 g，加800 mL水浸泡30 min，煎煮1.5 h，紗布濾過，濾液保存。藥渣再煎煮2次，合并煎液，濃縮至200 mL。加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，使溶液中乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％，靜置，待沉淀完全，6000 r．min(-1)離心10 min，棄去上清液。沉淀用200 mL熱水溶解，重復(fù)上步醇沉操作3次。沉淀分別用無水乙醚、丙酮多次洗滌，待揮干后，轉(zhuǎn)移至已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，60 ℃真空干燥，得精制多糖2.3080 g，得率為2.31％。

2.3供試液制備

精密稱取多糖精制品0.0052 g，用蒸餾水溶解后定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即為多糖供試液。

2.4多糖含量測(cè)定

精密吸取多糖供試液1.0 mL，按“2.1”項(xiàng)下方法，連續(xù)測(cè)定3次。平均吸光度值為0.36898，依回歸方程，得精制多糖含量為71.78％。根據(jù)精制多糖含量×精制多糖總量/原藥材量，得金線吊烏龜原藥材中總多糖含量為1.66％。

3　方法學(xué)考察

3.1精密度試驗(yàn)

取1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法連續(xù)測(cè)定6次，平均吸光度值為0.62466，RSD值為2.02％，表明方法精密度良好。

3.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試樣品溶液1.0mL，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法每隔30 min測(cè)定吸光度值，測(cè)定6次，得平均吸光度值為0.37294，RSD值為2.77％，表明供試液在150 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。

3.3重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取多糖供試液1.0 mL 6 份，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度值，多糖含量分別為69.78％、71.39％、71.68％、75.80％、73.13％、71.78％。多糖含量平均值為72.26％，RSD值為0.30％，表明重復(fù)性良好。

3.4加樣回收率試驗(yàn)

稱取60℃干燥恒重的精制多糖樣品0.1g，共6份，精密稱定，分別置于1000 mL容量瓶中，分為三組，每組兩份。按照每組樣品多糖含量的80％、100％、120％分別加入葡萄糖對(duì)照品，加蒸餾水定容。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，表明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

4　討論

中藥多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，是中藥主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降血糖、抗輻射、延緩衰老和抗感染等藥理作用([8,9])。所以，金線吊烏龜?shù)囊恍┧幚砘钚钥赡芘c其中多糖有關(guān)，其多糖有待進(jìn)一步開發(fā)利用。

本實(shí)驗(yàn)初步建立金線吊烏龜多糖的提取和含量測(cè)定方法, 采用水提醇沉方法提取、純化多糖，硫酸一苯酚比色法測(cè)定多糖含量。實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％的乙醇醇沉以除去苷類及生物堿等成分，用乙醚、丙酮除去脂溶性雜質(zhì)以及一些干擾性色素。采用水提醇沉法提取多糖，操作簡(jiǎn)便、條件溫和，但由于操作中多次轉(zhuǎn)移難免導(dǎo)致成分損失，使測(cè)定結(jié)果偏低。由于多糖類化學(xué)成分在硫酸的作用下，水解成單糖分子，迅速脫水生成糖醛類化合物，然后與苯酚合成有色化合物,可用比色法測(cè)定其含量。通過方法學(xué)考察，試驗(yàn)結(jié)果表明，用苯酚一硫酸比色法測(cè)定金線吊烏龜多糖含量，該測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，150 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，精密度和重復(fù)性良好，可為進(jìn)一步研究金線吊烏龜多糖提供參考。

[1]玉艷珍,鄧業(yè)成,張明,等.中藥植物金線吊烏龜對(duì)植物病原真菌的抗菌活性[J].植物保護(hù),2010,02:123

[2]余蘭,陳華,婁方明.洛龍黨參的多糖含量測(cè)定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,07:190.

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[4]魏學(xué)軍,林先燕,夏亞蘭,等.民族藥金耳環(huán)多糖的提取和含量測(cè)定[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,06:86-88.

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(責(zé)任編輯：李蕓霞)

Determination of polysaccharide content from Jinxiandiaowugui

SHANG Ning-ning1, YU Ya-jie1, PENG Teng1, GAO Peng2
(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan;2.Chengdu YuQuanLvJian Technology Ltd, Co, Chengdu 610072, Sichuan)

[Abstract]Objective: To detect the content of polysaccharide from Jinxiandiaowugui.Method: The polysaccharide from Jinxiandiaowugui was extracted and purified by water-extraction and alcohol-precipitation method.The standard curve was established using glucose standard solution.Sulfuric acid-phenol colorimetric method was applied to detect polysaccharide content from Jinxiandiaowugui at the wave length of 490nm.Result: The yield rate of refined polysaccharide from Jinxiandiaowugui was 2.31％.The content of refined polysaccharide was 71.78％.The content of total polysaccharide from original medicinal materials of Jinxiandiaowugui was 1.66％.Conclusion: The sulfuric acid-phenol colorimetric method used in detection of polysaccharide content from Jinxiandiaowugui is simple and rapid.The result is accurate with high stability, precision and repeatability.

[Key words]Jinxiandiaowugui; polysaccharide; content determination

[收稿日期]2015-04-13

[通訊作者]彭騰（1973-），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方向研究Tel:13880376673 Email:Pengteng1973@sina.com

[作者簡(jiǎn)介]尚寧寧（1987-)，女，碩士研究生，主要從事：藥物化學(xué)方向研究Tel:18381076108 Email:1101451408@qq.com

[中圖分類號(hào)]R 284.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-926X(2016)01-005-02