李奇娟，胡慧玲，王戰(zhàn)國，王友

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四川栽培和野生型大黃五種蒽醌類成分的含量對(duì)比研究

李奇娟1，胡慧玲1，王戰(zhàn)國2，王友3

[摘要]目的：比較分析四川栽培和野生型大黃五種蒽醌類成分的含量差異。方法：采用Chromasil C(18)色譜柱（5μm，250 × 4.6 mm），流動(dòng)相為甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長254 nm。結(jié)果：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別在4.1～65.1、3.9～63.1、4.0～63.4、4.1～66.0、2.0～31.6 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好（R2≥0.9996），平均加樣回收率為96.47～102.38 ％，RSD均小于2.56 ％。采用建立的HPLC方法測(cè)定茂縣、北川兩地栽培的唐古特三年生大黃及野生型唐古特大黃、藥用大黃等6批樣品中五種蒽醌類成分的總含量分別為2.33 ± 0.02，2.42 ± 0.03，2.88 ± 0.02，1.63 ± 0.04，3.51 ± 0.07，2.76 ± 0.06 ％，結(jié)果表明，栽培唐古特大黃均已達(dá)到2010版中國藥典規(guī)定的藥用標(biāo)準(zhǔn)，但是較野生型唐古特大黃的總蒽醌含量要低，其與野生型藥用大黃相當(dāng)。結(jié)論：栽培唐古特大黃符合藥典藥用標(biāo)準(zhǔn)，但總蒽醌含量較野生型含量低。其結(jié)果可為臨床應(yīng)用栽培大黃提供參考。

[關(guān)鍵詞]蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；栽培大黃

[作者單位]1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院（護(hù)理學(xué)院），四川 成都610106；3.阿壩州犇鴻天然中藥材有限責(zé)任公司，四川 茂縣 623200

大黃為多民族常用藥[1]，蒙古藥音譯為給喜古訥，維吾爾藥音譯為熱萬，藏藥音譯為君札，羌藥音譯為刷格或崇隔等。中國藥典收載大黃為蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(R.tanguticum Maxim.ex Balf.)、藥用大黃(R.officinale Bailll.)的干燥根和根莖[2]。唐古特大黃主要分布在青海、西藏、四川、甘肅等地，藥用大黃在四川分布較廣；栽培大黃多為唐古特大黃。大黃主要含蒽醌類成分，包括大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚及其苷類成分，其測(cè)定方法多采用HPLC測(cè)定酸水解后的這五種成分的含量來控制大黃的質(zhì)量[2～6]。本實(shí)驗(yàn)以《中華人民共和國藥典》(2010版第一部) 所載HPLC方法為參考，通過調(diào)整色譜條件建立HPLC分析方法[2～6]，測(cè)定和比較了茂縣、北川兩地栽培唐古特三年生大黃及野生型藥用大黃、唐古特大黃中五種蒽醌類成分的含量，其結(jié)果對(duì)人工栽培大黃質(zhì)量控制具有較大意義，同時(shí)可為人工栽培大黃的臨床合理應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1　儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀（HPLC），包括4元泵系統(tǒng)、全自動(dòng)脫氣單元、VWD 檢測(cè)器單元和Agilent 1100 色譜工作站等（Agilent Techologies，USA）；CP225D 和BS 210S 電子天平（Sartorius，德國）；KH-300DB 型數(shù)控超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Chromasil C18色譜柱（5μm，250 × 4.6 mm）（成都為科學(xué)儀器有限公司，中國）。TGL-16C 臺(tái)式高速離心機(jī)（上海市安亭科技儀器廠）；WSD-II型超純水系統(tǒng)（成都威思達(dá)智能科技有限公司）。

栽培大黃采集于茂縣雅都鄉(xiāng)（ZP1）和土門鄉(xiāng)（ZP2），北川羌族自治縣構(gòu)枝鄉(xiāng)（ZP3）和梓潼鄉(xiāng)（ZP4），經(jīng)鑒定均為唐古特大黃；野生型唐古特大黃（YS1）、藥用大黃（YS2）均采集于茂縣雅都鄉(xiāng)。蘆薈大黃素（批號(hào)L-014-140730，≥98％）、大黃酸（批號(hào)D-010-140728-2，≥98％）、大黃酚（批號(hào)D-017-150115，≥98％）、大黃素（批號(hào)D-029-140728-2，≥98％）、大黃素甲醚（批號(hào)D-004-140728-1，≥98％）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱，Chromasil C18色譜柱（5μm，250 × 4.6 mm）；流動(dòng)相，甲醇-0.1％磷酸溶液（每1000mL含1mL磷酸）為85:15（V/V）；檢測(cè)波長，254 nm；流速，1.0 mL/min，柱溫：30℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.2對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品（16.28 mg）、大黃酸對(duì)照品（15.79 mg）、大黃素對(duì)照品（15.84 mg）、大黃酚對(duì)照品（16.50 mg）和大黃素甲醚對(duì)照品（7.89 mg）適量，分別置于50 mL的棕色容量瓶中，分別加甲醇制成每1mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別為325.7、315.7、316.8、330.1、157.8 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述對(duì)照品溶液各2 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，混勻定容至刻度，即得每1mL中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別為65.1、63.1、63.4、66.0、31.6 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.3供試品溶液的制備

分別精密稱取6批不同批號(hào)（ZP1-4，YS1-2）的粉碎過四號(hào)篩大黃粉末樣品（n=3）約 0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8％鹽酸溶液10 mL，超聲處理2分鐘，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1小時(shí)，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm濾頭過濾，即得。

2.4線性關(guān)系考察

將混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液作為線性關(guān)系考察1號(hào)對(duì)照品溶液（S1）；另采用倍數(shù)稀釋法，精密量取S1對(duì)照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約 4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得2號(hào)對(duì)照品溶液（S2）；精密量取S2對(duì)照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得3號(hào)對(duì)照品溶液（S3）；按上法，依次獲得 S4～S5。S1～S5對(duì)照品溶液分別過 0.45 μm 微孔濾膜后，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別在4.1～65.1、3.9～63.1、4.0～63.4、4.1～66.0、2.0～31.6 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好（R2≥0.999 6）。

2.5系統(tǒng)適應(yīng)性考察

選擇3號(hào)對(duì)照品溶液（S3），大黃供試品溶液（樣品ZP1），按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖（圖1）。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰形尖銳對(duì)稱，保留時(shí)間分別約為5.8、6.1、11.3、15.2、21.8 min，與其他色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5000，拖尾因子符合分析要求，供試品溶液中其它物質(zhì)不干擾此五種成分的測(cè)定。

圖1　大黃供試品溶液（ZP1）和對(duì)照品溶液(S3)的HPLC色譜圖

2.6精密度試驗(yàn)

選擇對(duì)照品溶液（S3），按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別連續(xù)進(jìn)樣 5 次，記錄色譜圖，記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積數(shù)據(jù)，其峰面積的RSD均小于2.36 ％，表明精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（ZP1）溶液，在室溫（21 ℃）條件下分別于 0，4，8，16，24 h 按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積數(shù)據(jù)，其峰面積的RSD均小于3.24％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.8重現(xiàn)性試驗(yàn)

取樣品（ZP1），按供試品溶液制備方法，平行制備供試品溶液5份，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量分別為0.54 ± 0.01、0.37 ± 0.00、0.24 ± 0.00、、0.93 ± 0.01、0.25 ± 0.00％，其五種成分含量的RSD均小于2.56％，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取重現(xiàn)性用試驗(yàn)樣品（ZP1）共5份，每份精密稱取0.10 g，按照“2.3 供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備樣品，于“殘?jiān)蛹状际谷芙狻焙?，分別精密加入混合對(duì)照品貯備液S1（1 mL），轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm濾頭過濾，即得供加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定樣品，按照按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量。加樣回收率按如下公式計(jì)算，即（測(cè)得含量-已知樣品中的含量）/加入對(duì)照品量×100％，結(jié)果顯示，此五種成分的平均加樣回收率為96.47～102.38 ％，RSD均＜2.56 ％。表明方法加樣回收率符合要求。

2.10樣品含量測(cè)定

采用所建立的HPLC方法分別測(cè)定6批大黃樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量，結(jié)果見表1。

表1　大黃樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

結(jié)果表明，茂縣、北川兩地的栽培三年的唐古特大黃均已達(dá)到中國藥典2010版規(guī)定的藥用標(biāo)準(zhǔn)，但是較野生型唐古特大黃的總蒽醌含量要低，但與野生型藥用大黃相當(dāng)。值得注意的是ZP4樣品中五種蒽醌類成分的總含量相對(duì)較低，僅僅略高于藥典標(biāo)準(zhǔn)的1.50％，分析可能是由于采集的新鮮樣品有明顯腐敗發(fā)生導(dǎo)致的。

3　討論

試驗(yàn)參照藥典和相關(guān)文獻(xiàn)方法[1～6]，以大黃樣品水解后的總蒽醌苷元即蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚為指標(biāo)，探討分析了四川茂縣、北川兩地栽培型唐古特大黃與野生型大黃的含量差異。本文所建立的HPLC同時(shí)測(cè)定大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的分析方法，可用于開展栽培大黃不同生長年限、不同產(chǎn)地間的品質(zhì)評(píng)價(jià)分析研究，有利于大黃人工栽培技術(shù)的發(fā)展及栽培大黃的臨床應(yīng)用。其結(jié)果可為進(jìn)一步開展多產(chǎn)地、多樣品中此五種成分的比例關(guān)系研究，開展大黃的藥效學(xué)、臨床療效評(píng)價(jià)等研究提供依據(jù)。

備注：感謝北川羌族自治縣中羌醫(yī)醫(yī)院提供大黃樣品。

[參考文獻(xiàn)]

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[4]林瑞民,李磊,陳華山,等.不同品種不同產(chǎn)地大黃中五種蒽醌類化合物的HPLC測(cè)定[J].中藥材,2005,03:197-198.

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[6]鄒亮,周濃,謝靜,等.栽培藥用大黃不同部位中5種蒽醌類衍生物的含量分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,18:118-122.

（責(zé)任編輯：何瑤）

Comparative research of the contents of five anthraquinones from Dahuang of cultivated and wild varieties in Sichuan

LI Qi-juan1, HU Hui-ling1, WANG Zhan-guo2,WANG You3
(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan; 2.Chengdu University School of Medicine , Chengdu 610106, Sichuan;3.Aba Prefecture Benhong Nature herbal medicine Co.Ltd., Maoxian 623200, Sichuan)

[Abstract]Objective: To compare the differences of contents of five anthraquinones from cultivated and wild Dahuang in Sichuan.Method: C(18)Chromasil chromatography column (5μm, 250*4.6mm) was used in the determination.Mobile phase was methanol-0.1％phosphoric acid solution (85: 15) with flow rate of was 1.0mL．min(-1).Column temperature was 30℃, and detection wavelength was set at 254nm.Result: Aloe-emodin, rhein, eomdin, chrysophanol and physcion contents had a good linear relationship with peak area in the range of constituents of 4.1～65.1 μg．mL(-1), 3.9～63.1 μg．mL(-1), 4.0～63.4 μg．mL(-1), 4.1～66.0 μg．mL(-1), 2.0～31.6 μg．mL(-1)(R2≥0.9996).The average recovery was 96.47～102.38％, RSD＜2.56 ％.The total contents of five anthraquinones in six samples including triennial cultivated and wild varieties in Maoxian and Beichuan were 2.33 ± 0.02, 2.42 ± 0.03, 2.88 ± 0.02, 1.63 ± 0.04, 3.51 ± 0.07, 2.76 ± 0.06 ％ by the HPLC method.It turned out that cultivated R.tanguticum Maxim.ex Balf.had reached the standard in Pharmacopoeia of China (2010).The content of total anthraquinone was equal to wild R.Officinale Baill., but it was lower than wild R.tanguticum Maxim.ex Balf.Conclusion: R.tanguticum Maxim.ex Balf.of cultivated variety conforms to the standard in Pharmacopoeia of China, but the contents of total anthraquinone are lower than the wild variety.The result can provide reference for clinical application of Rhei Radix of cultivated variety.

[Key words]Aloe-emodin; rhein; eomdin; chrysophanol; physcion; cultivated Dahuang

[收稿日期]2015-11-20

[通訊作者]胡慧玲，女，副教授，主要從事中藥制劑學(xué)研究Email:hhlmedicine@126.com

[作者簡介]李奇娟，女，2012級(jí)中藥基地班Email:18380445398@163.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81403178)，四川省科技廳項(xiàng)目(2014SZ0131)

[中圖分類號(hào)]R 282

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-926X(2016)01-002-04