宋 晶，馬景微，曹謹玲，劉少貞

（山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801）

螯蝦屬于甲殼綱、十足目、螯蝦總科，螯蝦科（Cambaridae）現(xiàn)分為12個屬，分布于除美國、加拿大西部太平洋沿岸地區(qū)的整個北美洲大陸，日本以及亞洲東部的國家地區(qū)。我國分布2屬4種，其中東北螯蝦（Cambaroides dauricus）、朝鮮螯蝦（Cambaroides similis） 和許郎螯蝦（Cambaroides schrenkii）為中國的本地品種，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）原產于北美，20世紀30年代由日本引進中國并逐漸成為優(yōu)勢種，是中國重要的水產資源[1-2]。中國淡水螯蝦產業(yè)近20年來的進出口總量不斷增加，許多淡水螯蝦品類經濟價值較高，是重要的水產經濟動物。除了部分供給水產品市場，很多體型、體色特異的種類也當作寵物進行養(yǎng)殖[3]。

螯蝦體征相似，種內體色差異大，依賴形態(tài)進行分類有一定的局限性，因其表型和遺傳的數(shù)據有著明顯差異，其中一個明顯的弊端就是很難排除可能受到趨同進化的干擾[4]。在物種的進化歷程中，DNA分子是遺傳信息的載體，也是動物進化歷史的忠實記錄者。DNA分子一級序列中的所有堿基都具有較為獨立的特征，極少會受到趨同適應的干擾。因此，可將DNA分子提供的一級序列的信息作為螯蝦科系統(tǒng)分類的依據。其中，線粒體基因的結構簡單、母系遺傳、無內含子、進化速度快且不發(fā)生重組，作為一種分子標記技術被廣泛應用[5]。

隨著分子系統(tǒng)學的發(fā)展，使人們更加熱衷于從分子水平上研究物種的系統(tǒng)發(fā)生關系，而系統(tǒng)發(fā)育樹可用類似樹狀分支的圖直接展示各種生物之間可能的親緣關系。主要是通過DNA序列、蛋白質序列、蛋白質結構等來構建系統(tǒng)發(fā)育樹，蛋白質結構比較利用剛體結構疊合和多結構特征比較等方法建立結構進化樹。近十年來，國外已有學者相繼利用分子手段研究了巨石螯蝦屬的系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理[6]、螯蝦屬穴居種類的進化史[7]、侏儒螯蝦亞科的進化和系統(tǒng)學[8]，2012年，Breinholt還提出了淡水螯蝦科各屬的進化假說[9]，但螯蝦科各屬的親緣關系仍尚無定論。本研究旨在應用分子生物學技術對螯蝦科進行分類及進化關系的研究，使得螯蝦科在分子層面上的分類程度更加成熟，從而能夠為螯蝦系統(tǒng)分類研究提供一個有效利用資源的途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

從 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載獲得隸屬于螯蝦科的螯蝦屬、擬螯蝦屬、叉肢螯蝦屬、原螯蝦屬、侏儒螯蝦屬和Fallicambarus屬中的18種螯蝦（表1）的線粒體序列提取12S rRNA和COⅠ基因，選用親緣關系適中的普通濱蟹（C.maenas）為外群。

表1 物種名稱和GenBank登錄號

1.2 試驗方法

將所有序列用NCBI網站提供的Blast分析工具包進行相似性檢索，確認實驗所得序列為目的片段。所有具備已知序列的物種都進行堿基序列變異統(tǒng)計，然后存入文本文檔中，修改為“.fasta”格式，進行比對、剪切之后將前面的文件轉化格式為“.meg”格式，再進行激活，運用軟件MEGA 6.0計算序列的種間遺傳距離，選擇普通濱蟹（C.maenas）作為外群，最后構建進化樹。

多種軟件都可用于分析分子數(shù)據來重建系統(tǒng)發(fā)育樹，然而沒有單一的方法對所有情況都能取得很好的效果。比選擇軟件更重要的是生物信息數(shù)據的質量，軟件不具備對輸入數(shù)據進行更正的功能，所以采用不同進化速率的基因和多種構樹方法來實現(xiàn)系統(tǒng)分析是較為合適的選擇。本研究采用了鄰接法（Neighbour-Joining，NJ） 和最大似然法（Maximum Likelihood，ML）來構建螯蝦科部分屬、種的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 堿基序列變異比

從下載的線粒體全序列中選取12S rRNA、COⅠ線粒體序列，基于Kimura雙參數(shù)模型，計算螯蝦科種間遺傳距離P值。基于12S rRNA序列的螯蝦科種間遺傳距離為0.002～0.127，平均P值為0.048；基于COⅠ基因的螯蝦科種間遺傳距離為0.031～0.351，平均遺傳距離為0.161。由此可知，12S rRNA基因的進化速度遠大于COⅠ基因，基因進化速率的差異很可能是導致構建的系統(tǒng)進化樹產生不同拓撲結構的原因[10]。

2.2 分子系統(tǒng)進化

鄰接法是基于距離的建樹方法，其最大優(yōu)勢是運算十分簡便快捷，然而對各位點的具體情況不進行考慮，因此容易丟失一些遺傳信息。最大似然法是由樣本估測值估計總體參數(shù)的方法，該方法在每組序列比對中考慮了每個核苷酸替換的概率，因此計算復雜，耗時較長[11]。以普通濱蟹為外群，用Bootstrap法檢驗，1 000次重復抽樣得到結點的置信度來構建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1、圖2）。

共用ML法和NJ法2種方法建立的系統(tǒng)進化樹，得到的結果具有相似的拓撲結構，并且都具有較高的節(jié)點支持率。本研究的2種系統(tǒng)進化樹中關于螯蝦科的拓撲型與形態(tài)學分類結構基本一致，表明螯蝦科的12S rRNA及COⅠ基因序列可用于屬間的系統(tǒng)發(fā)生關系分析，構建的進化樹結果可靠。但是在個別分區(qū)有與經典的形態(tài)分類不相符的地方，如未定名種Cambarus sp.的歸屬及有效性都有爭議，系統(tǒng)發(fā)育分析的結果表示，其很可能不屬于螯蝦屬，而與擬螯蝦屬有著更高的遺傳相似度。而藍鉆螯蝦（C.rusticiformis）也顯示出與叉肢螯蝦屬有較近的親緣關系。

3 討論

形態(tài)分類的參數(shù)較多且穩(wěn)定性不足，因此趨同進化有時會使傳統(tǒng)的形態(tài)分類變得混亂。對于螯蝦屬（Cambarus）的種類，多以螯蝦的特征作為屬下的分類依據，而同科的叉肢螯蝦屬（Orconectes），則多以生殖肢的形態(tài)作為分類特征。在利用生殖肢形態(tài)對原螯蝦屬（Procambarus）和叉肢螯蝦屬（Orconectes）進行亞屬劃分時，也都受到趨同進化的影響[9]。因此，可以利用生物信息數(shù)據構建系統(tǒng)發(fā)育樹，輔助傳統(tǒng)的經典分類。不同的基因進化速率不同，利用單一基因構造系統(tǒng)發(fā)育樹，很難準確地反映種屬之間的親緣關系。

分析螯蝦科18個物種的12S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。侏儒螯蝦屬、原螯蝦屬、叉肢螯蝦屬與Fallicambarus屬位于同一分支（節(jié)點支持率為ML樹88、NJ樹95），其中克氏原螯蝦先與侏儒螯蝦屬聚為一支，然后再與原螯蝦屬聚為一支，擬螯蝦屬與其平行進化，NJ樹與ML樹的節(jié)點支持率分別高達97和99。除了COⅠ基因構建的ML樹，克氏原螯蝦分類歸屬于原螯蝦屬，而對其他樹都有不同程度的擾動，其原因可能是由于外群選擇會影響基于距離的構樹方法和12S rRNA序列較短（僅257 bp）所致[11]。分析得到的螯蝦科18種類的COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。觀察得到這三種樹的拓撲圖總體趨勢相似，其中侏儒螯蝦屬與原螯蝦屬親緣關系較近，而螯蝦屬多數(shù)種類自成一支，F(xiàn)allicambarus屬較為特殊，總能獨立分出（節(jié)點支持率在82～97），進行平行進化。

根據數(shù)據分析得到結果與形態(tài)學分類比較一致，這進一步證明了線粒體12S rRNA及COⅠ基因序列可作為推斷種屬間關系的有效遺傳標記，而相對序列較長、進化速率也較快，COⅠ基因的分析結果與螯蝦科在屬這一級別上形態(tài)分類的契合度更高。在其他近緣種上也有相似的結論，如對于鎧甲蝦類的系統(tǒng)發(fā)育研究也曾采用16S rRNA及COⅠ基因進行研究，并證實COⅠ具有更好的指示效果[12]，本研究對螯蝦科部分種類的12S rRNA、COⅠ基因序列進行分析，探討了該科種類的系統(tǒng)發(fā)育關系，為相關研究提供了基礎實驗數(shù)據和分子證據。但因所用物種非常有限，分析結果不一定全面反映該科的系統(tǒng)發(fā)育關系，有待于下一步進行更廣泛和更深入的研究。

參考文獻：

［1］Crandall K A，Buhay J E.Global diversity of crayfish（Astac idae，Cambaridae，and Parastacidae-Decapoda）in freshw ater［J］.Hydrobiologia，2008，595（1）：295-301.

［2］慕 峰，成永旭，吳旭干.世界淡水螯蝦的分布與產業(yè)發(fā)展［J］.上海水產大學學報，2007，16（1）：64-71.

［3］Faulkes Z.Marmorkrebs （Procambarus fallax f.virginalis）are the most popular crayfish in the North American pet trade［J］.Knowl Manag Aquat Ecosyst，2015，416：20-35.

［4］Brown W M，George J R，Wilson A C.Rapid evolution of animal mitchondrial DNA［J］.P Natl Acad Sci USA，1979，76（4）：1967-1971.

［5］Avise J C，Arnold J，Ball R N M，et al.Intraspecific phylogeography：the mitochondrial bridge between popula tion genetics and systematic［J］.Annu Rev Ecol Syst，1987，18：489-522.

［6］Buhay J E，Moni G，Mann N，et al.Molecular taxonomy in the dark：evolutionary history，phylogeography，and diversity of cave crayfish in the subgenus Aviticambarus，genus Ca mbarus［J］.Mol Phylogenet Evol，2007，42（2）：435-448.

［7］Pedraza-Lara C，Doadrio I，Breinholt J W.Phylogeny and evolutionary patterns in the dwarf crayfish subfamily（Decapoda：Cambarellinae）［J］.Plos One，2012，7（11）：e48233.

［8］Trontelj P，Machino Y，Sket B.Phylogenetic and phylogeo graphic relationships in the crayfish genus Austropotamob ius inferred from mitochondrial COI gene sequences［J］.Mol Phylogenet Evol，2005，34（1）：212-226.

［9］Breinholt J W，Porter M L，Crandall K A.Testing phylogen etic hypotheses of the subgenera of the freshwater crayfish genus Cambarus（Decapoda：Cambaridae）［J］.Plos One，2012，7（9）：e46105.

［10］王利利，彭建軍，于冬梅，等.Cytb和12S rRNA基因進化速度對構建系統(tǒng)進化樹的影響［J］.安徽農業(yè)科學，2011，39（9）：5101-5103.

［11］張麗娜，榮昌鶴，何遠，等.常用系統(tǒng)發(fā)育樹構建算法和軟件鳥瞰［J］.動物學研究，2013，34（6）：640-650.

［12］劉昕明.深海熱液區(qū)幾種鎧甲蝦形態(tài)學分類及分子系統(tǒng)發(fā)育研究［D］.廈門：國家海洋局第三海洋研究所，2013：54-55.