潘　玲， 劉思川， 王利春， 趙　棟， 郭曉強(qiáng)， 齊慶蓉

(1.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院， 四川 成都　610041； 2.四川科倫藥業(yè)股份有限公司， 四川 成都　610071；

3.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都　610106)

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頭孢妥侖鈉在甲醇中的穩(wěn)定性研究

潘玲1， 劉思川2， 王利春2， 趙棟2， 郭曉強(qiáng)3， 齊慶蓉1

(1.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院， 四川 成都610041； 2.四川科倫藥業(yè)股份有限公司， 四川 成都610071；

3.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都610106)

摘要：對(duì)頭孢妥侖酯的重要中間體頭孢妥侖鈉在甲醇溶液中不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行考察.利用高效液相色譜監(jiān)控頭孢妥侖鈉在甲醇溶液中不同條件下降解雜質(zhì)含量的變化、合成及分離純化獲得雜質(zhì)單體，并用HRMS、1H-NMR對(duì)所分離的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，為制備頭孢妥侖酯選擇合適的溶劑提供參考.

關(guān)鍵詞：頭孢妥侖鈉;高效液相色譜;甲醇;穩(wěn)定性;雜質(zhì)

0引言

頭孢妥侖酯為第三代口服頭孢菌素類抗生素，主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌引起的感染，尤其對(duì)葡萄球菌屬顯示出很強(qiáng)的抗菌力,因而廣泛應(yīng)用于臨床[1].據(jù)報(bào)道，頭孢妥侖酯的合成路線都是通過(guò)頭孢妥侖鈉在DMF溶液中與特戊酸碘甲酯反應(yīng)生成頭孢妥侖酯[2-6].此合成路線由于DMF沸點(diǎn)高，后處理較復(fù)雜，因此，根據(jù)原料的性質(zhì)來(lái)選擇合適的溶劑尤為重要.頭孢妥侖鈉(Cefditoren Sodium)的化學(xué)名為(6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亞氨乙酰氨基]-3-[(Z)-2-(4-甲基-5-噻唑基)乙烯基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸鈉鹽，其結(jié)構(gòu)如圖1所示.溶解度實(shí)驗(yàn)表明，頭孢妥侖鈉在DMSO、DMF、冰醋酸中易溶，在甲醇中溶解，但DMSO、冰醋酸同DMF類似，沸點(diǎn)較高，所以該步反應(yīng)可考慮用甲醇作為溶劑.為此，本研究考察了頭孢妥侖鈉在甲醇溶液中的穩(wěn)定性.

1實(shí)驗(yàn)

1.1頭孢妥侖鈉在甲醇溶液中的穩(wěn)定性考察

1.1.1儀器及試劑.

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：SPD-10A型高效液相色譜儀(Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm))，日本島津公司；Varian Unity INOVA-400 MHz型核磁共振儀，美國(guó)安捷倫公司.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：甲醇，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純.

1.1.2樣品配制.

分別精密稱取頭孢妥侖鈉0.0150 g，置于100 mL的棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻；分別于室溫避光、室溫白熾燈、室溫波長(zhǎng)為254 nm的紫外燈、40 ℃油浴、冰箱3 ℃及-20 ℃放置.

1.1.3色譜條件.

實(shí)驗(yàn)色譜條件為：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相，0.025 mol/L甲酸銨(0.005 mol/L HCOOH調(diào)至pH值6.0)-甲醇-乙腈(70∶15∶15)；檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL.

從不同條件下的頭孢妥侖鈉甲醇溶液的HPLC譜圖(見圖2)中可以看出，在頭孢妥侖鈉主峰后存在2個(gè)較大雜質(zhì)峰M和N，相對(duì)保留時(shí)間分別為2.51和3.00，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，雜質(zhì)的含量逐漸增加(見表1～6).

圖2　頭孢妥侖鈉甲醇溶液的典型HPLC譜圖

表2　室溫白熾燈光照條件下的峰面積變化

表3　室溫波長(zhǎng)254 nm紫外燈照射條件下的峰面積變化

表4　冰箱冷藏(3 ℃)條件下的峰面積變化

表5　冰箱冷凍(-20 ℃)條件下的峰面積變化

表6　40 ℃油浴條件下的峰面積變化

2結(jié)果與分析

2.1不同條件下降解雜質(zhì)(M和N)的初步推斷

2.1.1雜質(zhì)M的推斷和鑒定.

有報(bào)道顯示，頭孢噻肟鈉結(jié)構(gòu)中的甲氧肟基通常是順式構(gòu)型(見圖3).一般情況下，順式異構(gòu)體的抗菌活性是反式異構(gòu)體的40～100倍.在光照的情況下，順式異構(gòu)體會(huì)向反式異構(gòu)體轉(zhuǎn)化，其鈉鹽水溶液在紫外光照射下45 min，有50%轉(zhuǎn)化為反式異構(gòu)體，4 h后，可達(dá)到95%的損失.

圖3頭孢噻肟鈉結(jié)構(gòu)

頭孢妥侖鈉的結(jié)構(gòu)與頭孢噻肟鈉相似，也含有甲氧肟基，故推測(cè)其中一個(gè)雜質(zhì)M可能為甲氧肟基的反式異構(gòu)體7-E-DAMAI(見圖4).

圖4　甲氧肟基的反式異構(gòu)體

為了驗(yàn)證這一推測(cè)，在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]的基礎(chǔ)上，本研究以7-ATCA為起始原料，與E-AE活性酯在四氫呋喃、三乙胺條件下室溫反應(yīng)制備7-E-異構(gòu)體，HPLC純度96%.由于頭孢妥侖鈉的HPLC檢測(cè)體系所用流動(dòng)相為pH值6.0的緩沖體系，鈉鹽和對(duì)應(yīng)的酸出峰時(shí)間相同，故該異構(gòu)體未成鈉鹽，直接用酸(7-E-DAMAA)作為定位研究的對(duì)照物(見圖5).

圖5對(duì)照物結(jié)構(gòu)

1H-NMR(400 MHz，d-DMSO)：δ9.50(d，J=8.0 Hz，1 H)，8.94(s，1 H)，7.47(s，1 H)，7.12(s，2 H)，6.70(d，J=11.6 Hz，1 H)，6.36(d，J=11.6 Hz，1 H)，5.82(dd，J=8.0,4.8 Hz，1 H)，5.22(d，J=4.8 Hz，1 H)，3.96(s，3 H)，3.48(m，2 H)，2.37(s，3 H)MS m/z:理論值，506.0501，實(shí)測(cè)值，507.0471[M+H]+.氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明該化合物結(jié)構(gòu)正確.為了進(jìn)一步確證，本研究比較了頭孢妥侖鈉的氫譜數(shù)據(jù)：1H-NMR(400 MHz，d-DMSO)：δ9.65(d，J=8.0 Hz，1 H)，8.89(s，1 H)，7.35(s，2 H)，6.75(d，J=11.6 Hz，1 H)，6.70(s，1 H)，6.38(d，J=11.6 Hz，1 H)，5.65(dd，J=8.0,4.8 Hz，1 H)，5.12(d，J=4.8 Hz，1 H)，3.82(s，3 H)，3.18(dd，J=114.8，17.2 Hz，2 H)，2.30(s，3 H).發(fā)現(xiàn)甲氧肟基構(gòu)型變化導(dǎo)致與碳氮雙鍵共軛的噻唑環(huán)上的次甲基上的氫的位移有明顯的變化.

2.1.2雜質(zhì)N的推斷和鑒定.

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，β-內(nèi)酰胺環(huán)是頭孢菌素分子中不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在一般酸堿催化、中性環(huán)境的水分子直接攻擊、分子內(nèi)氨基催化或親核進(jìn)攻下，其?；蹑I容易斷裂開環(huán).并且，C-3位連有強(qiáng)吸電子基團(tuán)或C-7位側(cè)鏈酰胺鍵連有供電子基團(tuán)可增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺環(huán)受親核攻擊的敏感性[12].由此推測(cè)，頭孢妥侖鈉的β-內(nèi)酰胺環(huán)在甲醇溶液中受甲氧基進(jìn)攻開環(huán)，生產(chǎn)雜質(zhì)N(見圖6).

為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究將頭孢妥侖鈉在白熾燈下產(chǎn)生的雜質(zhì)以飽和正丁醇為展開體系經(jīng)柱層析純化得雜質(zhì)N：1H-NMR(400 MHz，d-DMSO)：δ9.24(d，J=6.8 Hz，1 H)，8.63(s，1 H)，8.24(s，1 H)，7.28(s，2 H)，6.79(s，1 H)，6.61(s，1 H)，6.42(d，J=11.2Hz，1 H)，4.64(m，1 H)，4.55(t，J=8 Hz，1 H)，3.81(s，3 H)，3.73(s，3 H)，3.51(m，2 H)，2.35(s，3 H)MS m/z:理論值，560.0582，實(shí)測(cè)值，561.0672[M+H]+.氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明，該化合物結(jié)構(gòu)正確.

圖6雜質(zhì)N結(jié)構(gòu)

2.2不同條件下降解雜質(zhì)(M和N)的驗(yàn)證

2.2.1溶液的配制.

1)室溫避光6 h的頭孢妥侖鈉的甲醇溶液(A).精密稱取頭孢妥侖鈉0.0150 g，置于100 mL的棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制得0.15 mg/mL的溶液，室溫避光放置.

2)雜質(zhì)M溶液(B)與雜質(zhì)N溶液(C).分別精密稱取雜質(zhì)M和N各0.0150 g,分別置于100 mL棕色容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，制得0.15 mg/mL的溶液.

3)D為A、B、C等體積混合溶液.

2.2.2色譜條件.

實(shí)驗(yàn)色譜條件為：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相，0.025 mol/L甲酸銨(0.005mol/L HCOOH調(diào)至pH值6.0)-甲醇-乙腈(70∶15∶15)；檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30；進(jìn)樣量10 μL.

1)溶液A的HPLC圖譜顯示，室溫避光6 h的頭孢妥侖鈉的甲醇溶液中雜質(zhì)M的相對(duì)保留時(shí)間為2.51，雜質(zhì)N的相對(duì)保留時(shí)間為3.00.

2)溶液B的HPLC圖譜顯示，雜質(zhì)M的相對(duì)保留時(shí)間為2.51.

3)溶液C的HPLC圖譜顯示，雜質(zhì)N的相對(duì)保留時(shí)間為3.00.

4)溶液D的HPLC圖譜顯示，溶液A中室溫避光6小時(shí)的頭孢妥侖鈉的甲醇溶液中雜質(zhì)M和雜質(zhì)N的出峰時(shí)間分別與溶液B中雜質(zhì)M和溶液C中雜質(zhì)N的出峰時(shí)間重合.

2.3結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究的設(shè)計(jì)合成及分離純化得到的雜質(zhì)M和雜質(zhì)N與理論推測(cè)的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)一致，確證了頭孢妥侖鈉在甲醇中的主要降解產(chǎn)物.

3討論

在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，頭孢妥侖鈉在甲醇溶液中易受光照、溫度的影響產(chǎn)生相關(guān)雜質(zhì)，且雜質(zhì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加.所以，利用頭孢妥侖鈉制備頭孢妥侖酯的反應(yīng)不適合選擇甲醇作為溶劑.

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Stability of Cefditoren Sodium in Methanol

PANLing1,LIUSichuan2,WANGLichun2,ZHAODong2,GUOXiaoqiang3,QIQingrong1

(1.West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China;2.Kelun Pharmaceuticals, Co., Ltd., Chengdu 610071, China;3.School of Pharmacy and Bioengineering， Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Abstract:The paper studies the stability of cefditoren sodium which is an important intermediate of cefditoren pivoxil in methanol solution under different conditions.HPLC is used to monitor the change of impurity content of cefditoren sodium in methanol under different conditions.Synthesis,separation and purification are used to obtain the impurity.Then,the impurity is structurally analyzed by HRMS and1H-NMR.All provide references for selecting a suitable solvent for the preparation of cefditoren pivoxil.

Key words:cefditoren sodium;HPLC;methanol;stability;impurity

中圖分類號(hào)：R914；R978.1+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡(jiǎn)介：潘玲(1991 — )， 女， 碩士研究生， 從事藥物化學(xué)研究.

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技重大專項(xiàng)——重大新藥創(chuàng)制(2012ZX09202101-013)資助項(xiàng)目.

收稿日期：2016-01-14.

文章編號(hào)：1004-5422(2016)01-0001-04