金學(xué)博,　柳　青,　尹悅佳,　金永梅,　王云鵬,　于　瑩,　韓四平*

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118;

2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 長(zhǎng)春 130033;

3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 哈爾濱150086

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一種新型幾丁質(zhì)酶基因LcChi2在轉(zhuǎn)基因水稻中的功能分析

金學(xué)博1,2,柳青2,尹悅佳2,金永梅2,王云鵬2,于瑩3,韓四平2*

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118;

2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 長(zhǎng)春 130033;

3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 哈爾濱150086

摘要：LcChi2是從羊草中克隆獲得的一種新型幾丁質(zhì)酶基因，生物信息學(xué)分析表明該基因表達(dá)一個(gè)Ⅱ類幾丁質(zhì)酶，屬于19家族。在雙子葉模式植物煙草中過(guò)表達(dá)該基因表現(xiàn)為抗真菌病害的生物學(xué)功能提高，然而在單子葉植物中是否具有抗病功能至今未知。以吉林省主栽水稻品種吉粳88為供試材料，構(gòu)建了含LcChi2基因和除草劑篩選標(biāo)記Bar基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功獲得LcChi2和Bar基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻。T1代轉(zhuǎn)基因水稻的PCR、RT-PCR和幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)結(jié)果表明LcChi2基因已成功整合到水稻基因組中，并且表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)出較高的外源幾丁質(zhì)酶活性；稻瘟病活體接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該基因顯著提高了水稻的抗病性；抗除草劑鑒定結(jié)果表明獲得的轉(zhuǎn)基因水稻新材料同時(shí)具有除草劑抗性。研究結(jié)果證明LcChi2基因可有效提高單子葉植物的抗病性，該基因在利用現(xiàn)代生物技術(shù)開展抗病作物遺傳改良方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：LcChi2；單子葉植物；轉(zhuǎn)基因水稻；抗病性

幾丁質(zhì)是昆蟲甲殼和大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，廣泛分布于自然界中。幾丁質(zhì)酶能催化水解幾丁質(zhì)多聚體中的 β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖或低分子量的幾丁寡糖[1]。根據(jù)幾丁質(zhì)酶催化區(qū)氨基酸序列的同源性，可以把幾丁質(zhì)酶分為18、19、20家族。18家族的幾丁質(zhì)酶來(lái)源于細(xì)菌、真菌、病毒及一些植物；19家族的幾丁質(zhì)酶主要包括植物幾丁質(zhì)酶和部分鏈霉菌屬的幾丁質(zhì)酶；20家族包括鏈霉菌屬和人類的幾丁質(zhì)酶[2,3]。根據(jù)氨基酸序列特征，植物幾丁質(zhì)酶可分為5類。Ⅰ型幾丁質(zhì)酶含有2個(gè)保守區(qū)，其中N-端的保守區(qū)富含半胱氨酸。Ⅱ型幾丁質(zhì)酶缺少N-端保守區(qū)，但是氨基酸序列與Ⅰ型幾丁質(zhì)酶高度同源。Ⅱ型幾丁質(zhì)酶與前兩者不存在序列相似性，也不含有N-端保守區(qū)。Ⅳ型幾丁質(zhì)酶含有一個(gè)富含半胱氨酸的保守區(qū)和一個(gè)與Ⅰ型幾丁質(zhì)酶相似的高度保守的主結(jié)構(gòu)，但有4處缺失，分子量明顯小于Ⅰ型幾丁質(zhì)酶。Ⅴ型幾丁質(zhì)酶不同于前四型，但結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌Bacilluscirculans、Serratiamarcescens和Streptomycesplicatus的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶相近[4]。

幾丁質(zhì)酶催化真菌細(xì)胞壁主要成分幾丁質(zhì)的水解，因此具有抑制真菌生長(zhǎng)、繁殖的生物學(xué)功能[5]。幾丁質(zhì)酶在植物真菌病害基因工程研究中應(yīng)用十分廣泛[6]，目前已經(jīng)獲得了一批抗病性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株[7]。Xiao 等[8]將苦瓜幾丁質(zhì)酶(McCHIT1)基因轉(zhuǎn)入煙草和棉花，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)煙草黑脛病菌(Phytophthoranicotianae)和棉花枯萎病菌(Verticilliumwilt)的抗性均顯著強(qiáng)于對(duì)照?？渍萚9]將苦瓜幾丁質(zhì)酶基因與益母草抗菌肽基因轉(zhuǎn)入黑麥草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較非轉(zhuǎn)基因黑麥草明顯抗立枯絲核菌。Owen等[10]將小麥幾丁質(zhì)酶基因在胡蘿卜中過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)灰霉病和菌核病的抗性都明顯提高。

本實(shí)驗(yàn)室前期在羊草中發(fā)現(xiàn)一種幾丁質(zhì)酶基因LcChi2(NCBI登錄號(hào)：GQ397277)，生物信息學(xué)手段分析結(jié)果表明LcChi2與其他幾丁質(zhì)酶成員明顯不同，屬于幾丁質(zhì)酶家族的遠(yuǎn)緣成員，為Ⅱ類幾丁質(zhì)酶19家族成員。轉(zhuǎn)LcChi2基因煙草抗病性鑒定結(jié)果證實(shí)該基因過(guò)表達(dá)可以顯著提高雙子葉植物抗細(xì)菌和真菌的能力[11]，但是在單子葉植物尤其是作物中能否發(fā)揮抗病作用至今尚未知曉。篩選鑒定抗真菌病害水稻新種質(zhì)和發(fā)掘新型抗病功能基因?qū)τ诩涌炜沟疚敛∷拘缕贩N的培育具有重要意義。本研究以羊草中克隆的新型幾丁質(zhì)酶基因LcChi2為研究對(duì)象，以吉林省主栽粳稻品種吉粳88為測(cè)試對(duì)象，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法創(chuàng)制了LcChi2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻材料。進(jìn)一步通過(guò)PCR檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)、幾丁質(zhì)酶活性鑒定、除草劑草銨膦抗性鑒定以及稻瘟病抗性鑒定等一系列研究，系統(tǒng)性分析了LcChi2基因在單子葉植物水稻中的抗真菌病害效果，評(píng)估了該基因潛在的應(yīng)用價(jià)值，以期為水稻抗稻瘟病育種提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料本研究中羊草(Leymuschinensis)種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。用于轉(zhuǎn)化的水稻品種為吉林省主栽粳稻品種——吉粳88，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

1.1.2菌株與質(zhì)粒大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105及供試稻瘟病ZE18生理小種均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所保存。單子葉植物表達(dá)載體pTF101.1-ubi由浙江大學(xué)饋贈(zèng)。

1.1.3主要試劑實(shí)驗(yàn)中所使用的T4 DNA連接酶、RNAiso Plus RNA提取試劑盒、Prime Script RT reagent(gDNA Eraser)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、硫酸卡那霉素(Kanamycin)、利福霉素(Rifampicin)、壯觀霉素(Spectinomycin)均購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；幾丁質(zhì)酶測(cè)試盒(SG17)購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；草銨膦除草劑購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1羊草幾丁質(zhì)酶基因LcChi2的克隆將羊草培養(yǎng)至三葉期，用100 mmol/L Na2CO3脅迫處理24 h后，利用RNA提取試劑盒提取羊草葉片總RNA，并使用Prime Script RT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體步驟詳見說(shuō)明書。以cDNA為模板，利用LcChi2基因全長(zhǎng)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列如下:LcChi2S：ATGGCGAGGTTTGCTGCCC；LcChi2A：CTAGCTAGCGAAGTTTCGCTGGG。PCR反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，30 s，58℃，30 s，72℃，30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使用DNA膠回收試劑盒回收目的片段，方法參見說(shuō)明書。將回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證后將產(chǎn)物連入克隆載體pUC119-35s中。

1.2.2LcChi2氨基酸序列的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析利用DNAMAN6.0軟件對(duì)LcChi2蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。利用MEGA 3.1和Clustal X在線程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)對(duì)LcChi2蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3植物表達(dá)載體構(gòu)建利用BamHⅠ和SpeⅠ兩種內(nèi)切酶分別對(duì)pTF101.1-ubi和已構(gòu)建入LcChi2基因的克隆載體pUC119-35S-LcChi2進(jìn)行雙酶切，使用DNA膠回收試劑盒分別回收pTF101-ubi載體片段和LcChi2基因片段。利用T4 DNA連接酶連接兩片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選大腸桿菌單克隆后提取質(zhì)粒進(jìn)行目的基因PCR檢測(cè)及BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切驗(yàn)證。將篩選得到的陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證正確后將重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105中，用于后續(xù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻實(shí)驗(yàn)。

1.2.4水稻遺傳轉(zhuǎn)化水稻遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，參考林秀峰等的方法[12,13]。將去掉穎殼的水稻種子用70%酒精滅菌3 min，再用0.1%升汞滅菌15 min，然后用無(wú)菌蒸餾水沖洗5次后將種子移到滅菌濾紙上吸干。種子消毒后接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d，直到盾片膨大、胚乳變軟時(shí)，拔掉芽鞘，把余下的種子轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)28 d，挑選出淺黃、顆粒狀、質(zhì)地緊密的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每15 d繼代1次。從預(yù)培養(yǎng)5 d的愈傷組織中挑選色澤明亮、質(zhì)地緊密、表面干燥的愈傷組織分別與攜帶pTF101.1-ubi-LcChi2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105共培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)到30 mg/L草銨膦的篩選培養(yǎng)基上，篩選3次后，選取生長(zhǎng)正常、色澤亮黃且有抗性的愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基上，弱光培養(yǎng)10 d，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)40 d左右后分化成苗。將2 cm左右高的水稻幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。苗長(zhǎng)至8~10 cm左右時(shí)打開瓶口，7 d后移栽，單本插秧。

1.2.5轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)CTAB法[14]提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片DNA。根據(jù)LcChi2及Bar序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物。LcChi2F：ATCGCCGCCGCCAACACCTT，LcChi2R：CGCCGTCATCCAGAACCAC；BarF：TCAAATCTCGGTGACGGG，BarR：ATGAGCCCAGAACGACGC。LcChi2與Bar基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為339 bp及 552 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，30 s，58℃，30 s，72℃，30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6RT-PCR分析利用RNAiso Plus RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片總RNA。使用Prime Script RT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，分別用水稻內(nèi)參OsACT1引物和LcChi2特異性檢測(cè)引物L(fēng)cChi2F及LcChi2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。OsACT1-F：TGGCATCTCTCAGCACATTCC，OsACT1-R：TGCACAATGGATGGGTCAGA；PCR反應(yīng)條件同上述轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)方法。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.7轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻的幾丁質(zhì)酶活性鑒定對(duì)T1代3葉1心期轉(zhuǎn)基因水稻分離的陽(yáng)性材料與陰性材料葉片中的幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行測(cè)定，其中陽(yáng)性材料和陰性材料各3株，分別來(lái)源于不同T0代轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)其進(jìn)行葉片取樣，并制成粗酶液，使用幾丁質(zhì)酶試劑盒進(jìn)行酶活性測(cè)定，方法詳見幾丁質(zhì)酶試劑盒說(shuō)明書。

1.2.8轉(zhuǎn)基因水稻溫室內(nèi)稻瘟菌接種鑒定T1代轉(zhuǎn)基因水稻種子催芽后播于裝有稻田土的5 cm×15 cm×10 cm塑料育苗盤內(nèi)，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性材料與陰性材料各50粒，在溫室內(nèi)育苗，3葉1心期噴霧接種(菌株孢子濃度每100倍視野為20~50個(gè))后，25℃保濕保溫箱內(nèi)放置16~20 h，取出放于溫室內(nèi)，在有利于發(fā)病的溫濕度條件下保濕7 d后進(jìn)行發(fā)病情況觀察，照相并計(jì)算葉片相對(duì)病斑面積。

1.2.9轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻的抗除草劑鑒定以T1代轉(zhuǎn)基因水稻陰性材料作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性材料作為試驗(yàn)組，每組10株，3葉1心期對(duì)全株草噴施銨膦除草劑，噴施濃度為250 mg/L，3 d后再噴施1次，7 d后觀察藥害情況并照相。

2結(jié)果與分析

2.1羊草幾丁質(zhì)酶基因LcChi2的克隆

提取羊草葉片總RNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1A)。如圖所示，28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA電泳條帶清晰，表明提取RNA完整。將總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，利用LcChi2基因全長(zhǎng)特異性引物L(fēng)cChi2S、LcChi2A進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1B)。PCR擴(kuò)增獲得約770 bp的DNA片段，與所推測(cè)的771 bp片段大小一致，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，證實(shí)為正確的LcChi2序列片段。

2.2羊草幾丁質(zhì)酶LcChi2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及其氨基酸序列同源性比對(duì)分析

利用DNAMAN6.0軟件對(duì)LcChi2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析(圖2)。如圖2所示，黑色框代表完全一致的序列，灰色框代表相似的序列，黑線上面的羅馬數(shù)字代表可能存在的基序，黑色圓圈代表Cys49與Gly71位置上的19家族的幾丁質(zhì)酶特征1(PS00773)，黑色方塊代表Val與Met171位置上的19家族的幾丁質(zhì)酶特征2(PS00774)。研究結(jié)果表明LcChi2蛋白的氨基酸序列與其他植物幾丁質(zhì)酶氨基酸序列具有同源性。推測(cè)該幾丁質(zhì)酶LcChi2為Ⅱ類酶，并屬于19家族。

采用MEGA 3.1和Clustal X程序繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。如圖所示，羊草LcChi2蛋白與水稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、大麥(Hordeumvulgare)和小麥(Triticumaestivum)的幾丁質(zhì)酶有很近的親緣關(guān)系，氨基酸序列相似性分別為83%、94%、96%和96%，但與云杉、二色補(bǔ)血草、橡膠樹和玉米來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列相似性較低。

2.3單子葉植物表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

LcChi2基因植物表達(dá)載體構(gòu)建采用pTF101.1-ubi載體骨架，BamHⅠ和SpeⅠ位點(diǎn)雙酶切后，連接并進(jìn)行驗(yàn)證(圖4)，載體命名為pTF101.1-ubi-LcChi2。pTF101.1-ubi-LcChi2以2×CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的除草銨膦抗性基因Bar為篩選標(biāo)記，玉米組成型表達(dá)啟動(dòng)子 ZmUbi驅(qū)動(dòng)抗病基因LcChi2進(jìn)行過(guò)表達(dá)。將植物表達(dá)載體pTF101.1-ubi-LcChi2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中后，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化。共計(jì)獲得16個(gè)T0代轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻株系，T0代水稻自交得到T1代轉(zhuǎn)基因水稻種子。

圖1　羊草葉片幾丁質(zhì)酶基因總RNA提取和PCR檢測(cè)Fig.1　Preparation of LcChi2 RNA and its PCR products analysis.A:羊草葉片總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果；B:LcChi2基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。M:DNA 2 000 marker；1:LcChi2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2　LcChi2的氨基酸序列同源性比對(duì)分析Fig.2　Alignment of the deduced amino acid sequences of LcChi2.注:羊草與小麥、大麥、黑麥和川椒的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果。TaCHI-Ⅱ：小麥Ⅱ類幾丁質(zhì)酶；HvCHI-Ⅱ：大麥Ⅱ類幾丁質(zhì)酶；ScCHI-Ⅱ：黑麥Ⅱ類幾丁質(zhì)酶；CaCHI-Ⅱ：川椒Ⅱ類幾丁質(zhì)酶

圖3　LcChi2的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3　Construction of the phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of LcChi2.注:GenBank登錄號(hào)-幾丁質(zhì)酶:CAA55344-HvCHI-Ⅱ：大麥Ⅱ類幾丁質(zhì)酶；BAB82471-TaCHI-Ⅱ：大麥Ⅱ類幾丁質(zhì)酶；AAG53610-SCCHI-Ⅱ：黑麥Ⅱ類幾丁質(zhì)酶；AAC36359-CaCHI-Ⅱ：川椒Ⅱ類幾丁質(zhì)酶；ACV20870-LcChi2：羊草幾丁質(zhì)酶；BAD77932-CjCHI-Ⅳ：日本柳杉Ⅳ類幾丁質(zhì)酶；AAQ10093-VvCHl-Ⅳ：葡萄Ⅳ類幾丁質(zhì)酶；CAA74930-AtCH1-Ⅳ：擬南芥Ⅳ類幾丁質(zhì)酶；ACL36992-MsCHI-Ⅳ：紫花苜蓿Ⅳ類幾丁質(zhì)酶；AAP80801-GhCHI-Ⅶ：陸地棉Ⅶ類幾丁質(zhì)酶；AAD04295-VvCHT-Ⅰ：葡萄Ⅰ類幾丁質(zhì)酶；ADI56257-GhCHI-Ⅰ：陸地棉Ⅰ類幾丁質(zhì)酶；AAA62427-ZmCHI-Ⅰ：玉米Ⅰ類幾丁質(zhì)酶；AAC24807-StCHI-Ⅰ：馬鈴薯Ⅰ類幾丁質(zhì)酶；AAD05433-UdCHT-Ⅵ：大蕁麻Ⅵ類幾丁質(zhì)酶；AAN37391-CaCHI-Ⅲ：川椒Ⅲ類幾丁質(zhì)酶；CAA77657-NtCHI-Ⅲ類幾丁質(zhì)酶；CAA76203：LaCHI-Ⅲ：白羽扇豆Ⅲ類幾丁質(zhì)酶；AAM08773-OsCHI-Ⅲ：水稻Ⅲ類幾丁質(zhì)酶；AAT47713-HiCHI-Ⅴ：哈茨木霉Ⅴ類幾丁質(zhì)酶；AAM78075-McCH1-Ⅴ：苦瓜Ⅴ類幾丁質(zhì)酶；ACM45717-PpCHI-Ⅴ：沙梨Ⅴ類幾丁質(zhì)酶；CAA54374-NtCHI-Ⅴ：煙草Ⅴ類幾丁質(zhì)酶。

圖4　pTF101.1-ubi-LcChi2載體的構(gòu)建Fig.4　The construction of pTF101.1-ubi-LcChi2 vector.A：重組質(zhì)粒pTF101.1-ubi-LcChi2 PCR檢測(cè)結(jié)果。M：DNA 2 000 bp marker；1： pTF101.1-ubi-LcChi2質(zhì)粒；B：重組質(zhì)粒pTF101.1-ubi-LcChi2酶切驗(yàn)證結(jié)果(BamHⅠ/SpeⅠ)。M：DNA 15 000 bp marker；1： pTF101.1-ubi-LcChi2質(zhì)粒

2.4轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

對(duì)全部120株T1代轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)目的基因LcChi2的整合情況。 PCR檢測(cè)結(jié)果如圖5A所示，其中85份材料擴(kuò)增出條帶，證明為陽(yáng)性植株。PCR檢測(cè)結(jié)果表明LcChi2基因已成功整合到水稻基因組中。同時(shí)對(duì)上述材料中的除草劑標(biāo)記基因Bar進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5B所示，上述LcChi2基因檢測(cè)為陽(yáng)性的85株水稻材料均檢測(cè)出與Bar基因大小預(yù)期結(jié)果相符的電泳條帶，表明在所獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性材料中，LcChi2基因和Bar基因均以共同轉(zhuǎn)化形式整合到水稻基因組中。

圖5　部分轉(zhuǎn)LcChi2基因植株的PCR檢測(cè)Fig.5　PCR analysis of the LcChi2 transgenic rice.A：部分轉(zhuǎn)基因植株LcChi2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。B：部分轉(zhuǎn)基因植株Bar基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。M：DNA 2 000bp marker；1：空白對(duì)照(水)；2：陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒)；3：野生型植株(吉粳88)；4~15：轉(zhuǎn)LcChi2基因植株。

2.5LcChi2基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的轉(zhuǎn)錄水平分析

為分析LcChi2基因整合到水稻基因組后是否能正確轉(zhuǎn)錄，本研究選取T1代轉(zhuǎn)基因水稻為供試材料，進(jìn)行RT-PCR分析。如圖6A所示，內(nèi)參基因OsACT1具有較好的擴(kuò)增效率，證明RNA質(zhì)量完好；如圖6B所示，轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻陽(yáng)性植

株，均擴(kuò)增出清晰的339 bp的目標(biāo)片段，而陰性植株和空白對(duì)照均無(wú)條帶。結(jié)果表明LcChi2基因在轉(zhuǎn)基因水稻中可正常轉(zhuǎn)錄。

2.6轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻的幾丁質(zhì)酶活性鑒定

為進(jìn)一步檢測(cè)幾丁質(zhì)酶基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)情況,對(duì)陽(yáng)性和陰性轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行測(cè)定，其中陰性植株與陽(yáng)性植株各3株。結(jié)果表明，陽(yáng)性植株的幾丁質(zhì)酶活性明顯高于陰性植株，大約是陰性植株的3倍(圖7)。研究證明LcChi2基因在水稻中能夠有效表達(dá)，且能顯著提高水稻的幾丁質(zhì)酶活性。

2.7轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻的抗病性鑒定

為了鑒定轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻的抗病能力，本研究對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因水稻分離的陽(yáng)性植株和陰性植株葉片進(jìn)行了稻瘟病ZE18生理小種的接種實(shí)驗(yàn)，其中陽(yáng)性植株與陰性植株各50株。接種7 d后對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行觀察并照相(圖8A，彩圖見圖版一)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性材料病斑面積明顯小于陰性材料，陰性植株的感病面積是陽(yáng)性植株的約8倍(圖8B)，說(shuō)明LcChi2基因在水稻中具有抑制稻瘟病菌生長(zhǎng)和顯著提高轉(zhuǎn)基因植株抗病性的功能。

圖6　轉(zhuǎn)LcChi2基因植株轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.6　RT-PCR analysis of LcChi2 in transgenic rice.A：OsACT1基因RT-PCR擴(kuò)增。M：DNA 2 000 bp marker ；1：陰性植株；2：空白對(duì)照(水)；3~5：陽(yáng)性植株。B：LcChi2基因RT-PCR擴(kuò)增。M：DNA 2 000 bp marker；1：空白對(duì)照；2：陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒)；3：陰性植株；4~6：陽(yáng)性植株。

圖7　轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻幾丁質(zhì)酶活性鑒定Fig.7　Chitinase activity assay of the transgenic rice.CK-1、CK-2、CK-3：轉(zhuǎn)基因陰性植株；LcChi2-1、LcChi2-2、LcChi2-3：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

圖8　轉(zhuǎn)基因水稻的抗稻瘟病功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Fig.8　Disease resistance of the transgenic rice at seedling stage.A：轉(zhuǎn)基因水稻抗稻瘟病實(shí)驗(yàn)結(jié)果。CK：轉(zhuǎn)基因陰性植株；LcChi2：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。B：轉(zhuǎn)基因水稻葉片相對(duì)病斑面積比較。CK：轉(zhuǎn)基因陰性植株；LcChi2：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。(彩圖見圖版一)

2.8轉(zhuǎn)基因水稻的抗除草劑鑒定

對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行草銨膦抗性鑒定，其中陽(yáng)性材料與陰性材料各10株。結(jié)果顯示噴施草銨膦除草劑7 d后10株陽(yáng)性植株沒(méi)有觀察到明顯藥害，而10株陰性植株則全部死亡(圖9，彩圖見圖版一)。草銨膦噴施試驗(yàn)表明：陽(yáng)性植株具有明顯的抗草銨膦能力，說(shuō)明所獲的轉(zhuǎn)基因材料具有抗病及抗除草劑雙重功能。

圖9　轉(zhuǎn)基因水稻抗除草劑鑒定結(jié)果Fig.9　Herbicide resistance assessment of the transgenic rice.CK：轉(zhuǎn)基因陰性植株；LcChi2：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。(彩圖見圖版一)

3討論

真菌的細(xì)胞壁都含有幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)酶可直接水解真菌的細(xì)胞壁，水解后的細(xì)胞壁碎片可進(jìn)一步誘導(dǎo)植物的抗病性，也可與植物防御反應(yīng)的酶蛋白協(xié)同增效，在植物防御病原真菌侵害中發(fā)揮著重要的作用[15]。本研究從羊草中克隆的新型幾丁質(zhì)酶基因LcChi2屬于Ⅱ型幾丁質(zhì)酶的19家族，與已知克隆的幾丁質(zhì)酶基因相比，為遠(yuǎn)緣的新型幾丁質(zhì)酶基因。實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行了轉(zhuǎn)LcChi2基因煙草抗真菌病害功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，LcChi2基因的高表達(dá)明顯增強(qiáng)了雙子葉模式植物煙草的抗病性，說(shuō)明該幾丁質(zhì)酶基因在雙子葉植物中具有較強(qiáng)的抗病能力[11]。本研究將該基因轉(zhuǎn)入單子葉模式植物水稻中，發(fā)現(xiàn)該基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致水稻對(duì)稻瘟病ZE18生理小種抗性明顯增加。這些研究結(jié)果表明，LcChi2作為一個(gè)新的抗病基因，不僅適用于雙子葉植物，也適用于單子葉植物。LcChi2基因在單子葉作物上抗病功能的證實(shí)，擴(kuò)大了該基因在農(nóng)作物中的應(yīng)用范圍，具有更好地產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

稻瘟病嚴(yán)重地危害著水稻的產(chǎn)量，因此培育抗病水稻品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。稻瘟菌的致病性分化較快，生理小種多，變化大，水稻自身抗性資源有限，而且常規(guī)育種方法耗時(shí)較長(zhǎng)且效率不高，所培育的抗病品種遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上的實(shí)際需要[16]。基因工程技術(shù)的出現(xiàn)能夠有效打破中間基因的隔離，實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)育種方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的基因重組分子植物育種，為抗病作物育種開辟了一條新的途徑[17]。Itoh等[18]將外源幾丁質(zhì)酶基因?qū)氲剿局?，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照植株對(duì)稻瘟病的抗性明顯增強(qiáng)。Nandakumar等[19~21]在水稻中過(guò)表達(dá)幾丁酶基因顯著地提高了水稻對(duì)紋枯病的抗性。本研究獲得的轉(zhuǎn)基因抗病水稻，其受體材料為吉林省當(dāng)?shù)刂髟跃酒贩N吉粳88，由于利用了除草劑標(biāo)記的雙價(jià)植物表達(dá)載體，所以獲得的轉(zhuǎn)基因水稻新材料既具有稻瘟病抗性，又表現(xiàn)為高抗除草劑草銨膦。雙價(jià)農(nóng)藝性狀對(duì)未來(lái)在吉林省培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗病的水稻新品種提供了重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料。今后本課題組將繼續(xù)開展轉(zhuǎn)LcChi2基因水稻對(duì)其他細(xì)菌病和真菌病抗性的研究，以及是否影響產(chǎn)量等評(píng)估工作，進(jìn)一步深入解析LcChi2基因的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

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Functional Characterization of a Novel Chitinase GeneLcChi2 in Transgenic Rice

JIN Xue-bo1, 2, LIU Qing2, YIN Yue-jia2, JIN Yong-mei2, WANG Yun-peng2, YU Ying3, HAN Si-ping2*

1.SchoolofLifeScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.Agro-biotechnologyResearchInstitute,JilinAcademyofAgriculturalScience,Changchun130033,China;3.InstituteofIndustrialCrops,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China

Abstract:A new chitinase gene LcChi2 from Leymus chinensis showed enhanced resistance to fungal disease, when it was over-expressed in the dicotyledonous plant tobacco. Bioinformatics analysis suggested that LcChi2 encodes a type II chitinase classifying in the family 19. However, its resistance function to disease in the monocotyledon is unknown. In this study, we took Jijing 88, a widely grown Japonica rice cultivar in Jilin province, as the receptor plant of which the LcChi2 and herbicide screening marker gene Bar were transferred via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic rice at T1 stage was confirmed by PCR, RT-PCR and chitinase activity measurements, indicating that LcChi2 was integrated into the nuclear genome of rice and expressed effectively. The transgenic rice was artificially inoculated with the rice blast pathogens, showing higher resistance to the blast. Also, the transgenic rice exhibited herbicide resistance suggesting that the herbicide resistant gene Bar is functioning. Current results revealed that LcChi2 was able to improve the resistance to disease in the monocotyledons effectively, and might be used as a significant candidate disease-resistance gene for biotech breeding in the crops.

Key words:LcChi2; monocotyledon; transgenic rice; disease resistance

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.01

作者簡(jiǎn)介：金學(xué)博，碩士研究生，主要從事抗逆轉(zhuǎn)基因作物研究。 E-mail：1003097095@qq.com。*通信作者：韓四平，副研究員，主要從事作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。E-mail：Hansp@cjaas.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08003-005)；吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(吉財(cái)教[2012]1072)資助。

收稿日期：2016-01-18; 接受日期：2016-01-26