劉文彬,　郭輝力,　劉　歡,　黃麗娜,　張奮強,　馬蘭青*

1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京 102206;

2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室, 北京 102206

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煙草Nt4CL與虎杖PcSTS基因的融合表達與功能分析

劉文彬1,郭輝力2,劉歡1,黃麗娜2,張奮強1,馬蘭青2*

1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京 102206;

2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室, 北京 102206

摘要：4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase, 4CL)和芪合酶(stilbene synthase, STS)是白藜蘆醇苯丙氨酸代謝合成的最后兩個關(guān)鍵酶。運用懸掛PCR(overlap PCR)的方法將煙草4CL基因(Nt4CL)和虎杖STS基因(PcPKS5)用3個中性氨基酸鏈連接，得到融合基因Nt4CL-PcPKS5，將其插入原核表達載體中，構(gòu)建pET30a-Nt4CL-PcPKS5重組質(zhì)粒，表達Nt4CL-PcPKS5融合蛋白。經(jīng)Ni(2+)純化和PD-10柱脫鹽后，得到可溶性純化蛋白。體外酶促反應(yīng)結(jié)果表明該融合酶具有4CL和STS的雙重活性，其催化產(chǎn)物為白藜蘆醇。酶促反應(yīng)最適條件為：pH 6.5，反應(yīng)溫度為45℃。研究結(jié)果獲得了有效催化白藜蘆醇生物合成的雙功能融合酶，為進一步利用融合酶基因轉(zhuǎn)化工程菌株實現(xiàn)白藜蘆醇工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；融合基因；原核表達；酶促反應(yīng)

白藜蘆醇(resveratrol)是植物在受到生物或非生物脅迫時產(chǎn)生的一種能夠提高植物病原抗性和環(huán)境惡化的植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于各種漿果、花生以及虎杖(Polygonumcuspidatum)中[1]。日本學(xué)者Tokaoka在1940年首次從毛葉藜蘆(VeratrumgrandiflorumLoes.)中分離獲得[2]，隨后在虎杖根莖中分離出來[3]。1976年，白藜蘆醇作為一種植物自身產(chǎn)生的抗逆物質(zhì)在葡萄葉片中被發(fā)現(xiàn)[4]。目前已知白藜蘆醇主要存在于葡萄、桑椹、花生、買麻藤、桉樹、大黃等12科、31屬72種植物中，以葡萄屬植物中最多。Nonomura等[3]發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)是治療炎癥、脂類代謝紊亂以及心臟病的有效成分。大量的細胞或動物試驗表明白藜蘆醇在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、疏松血管、抗腫瘤、抗衰老、保護心腦血管和調(diào)控胰島素等方面都具有保健功能，在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用[5~7]。

目前，白藜蘆醇主要從植物中提取，但植物資源相對有限，又受地理條件和季節(jié)的影響，很難獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的白藜蘆醇。有機合成步驟繁雜，生產(chǎn)率低下，限制了有機合成工業(yè)的開發(fā)[8]。植物細胞工程、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成本較高，來源有限并且在時間及組織特異性上制約著白藜蘆醇的制備。微生物工程方法制備白藜蘆醇能夠在短期內(nèi)獲得大量目的產(chǎn)物，成為獲取白藜蘆醇新的有效途徑[9]。白藜蘆醇經(jīng)由苯丙氨酸代謝途徑(phenylpropanoid pathway)在植物體內(nèi)合成，4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)和芪合酶(stilbene synthase，STS)是該代謝途徑的最后兩步關(guān)鍵酶。分別過量表達一種關(guān)鍵酶可以有效提高白藜蘆醇的產(chǎn)量，但難以高水平積累[10]。研究發(fā)現(xiàn)將4CL和STS兩個關(guān)鍵酶基因在重組大腸桿菌中合成時，白藜蘆醇的產(chǎn)量為104.5 mg/L；而在重組酵母菌中合成白藜蘆醇時，白藜蘆醇的產(chǎn)量高達391 mg/L[11]。近年來，優(yōu)化蛋白技術(shù)及融合蛋白與蛋白支架上取得了顯著的成果。H?lsch[12]將甲酸脫氫酶(FDH)和3-酮?；?ACP還原酶(KR)通過不同長度的Linker融合，融合酶均表現(xiàn)出單酶的活性，并且顯著提高了初始催化速度，使底物轉(zhuǎn)化率達到99.97%。BulowL等[13]在探索構(gòu)建了雙功能酶及多功能酶分子研究中采用融合基因的方法，發(fā)現(xiàn)融合蛋白不僅能夠保留構(gòu)成酶分子各自的活性，而且對連續(xù)的催化反應(yīng)能產(chǎn)生“鄰近效應(yīng)”(proximity effect)。

因此，本研究運用懸掛PCR技術(shù)將煙草(Nicotianatabacum)4CL基因(Nt4CL)與虎杖STS基因(PcPKS5)用3個氨基酸(GGS)的Linker連接，嘗試在白藜蘆醇生物合成途徑的最后兩步中對其關(guān)鍵酶基因Nt4CL和PcSTS進行融合，以期獲得有效催化白藜蘆醇生物合成的融合酶。從而為進一步利用融合酶基因轉(zhuǎn)化工程菌株實現(xiàn)白藜蘆醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、表達宿主菌Rosetta為本實驗室保存，質(zhì)粒pCRT7/CT-TOPO-Nt4CL、pET30a-PcPKS5均已在前期工作[14]中構(gòu)建完成。

1.2主要試劑儀器

高純度質(zhì)粒小試劑盒購于康為世紀公司，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、OMEGA、dNTPs、X-Gal、EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶及Buffer、250 bp DNA Ladder Marker、IPTG、T4 DNA Ligase、pMD18-T載體均購于TaKaRa公司；TransStartTMFastPfu DNA聚合酶、Protein RluerTMⅣ購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍R-250、亮肽素、胰蛋白酶、PMSF、Dnase、溶菌酶、EDTA、咪唑、DTT、冰醋酸、甘氨酸、溴酚藍、丙烯酰胺儲液、SDS等用于蛋白純化及電泳試驗；酵母提取物、胰蛋白胨和瓊脂等均為分析純;Ni-NTA His-Bind鎳瓊脂糖購于北京鼎國生物公司；丙二酰輔酶A、輔酶A、白藜蘆醇標準品、ATP均購自Sigma公司；PD-10柱購于Amersham Pharmacia Biotech公司。上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行引物合成及測序服務(wù)。

1.3融合酶基因的克隆

依據(jù)GenBank中已注冊的Nt4CL(登錄號：U50846)和PcPKS5(登錄號：ACC76753)的序列，設(shè)計兩對引物F1、R1和F2、R2(表1)，分別用來擴增Nt4CL與PcPKS5的基因片段。以擴增的Nt4CL與PcPKS5為模板，F(xiàn)1、R2為引物擴增含Linker長度為3個氨基酸(GGS)的Nt4CL-PcPKS5融合基因。引物F1、R2中分別引入酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ，用于原核表達載體構(gòu)建。

提取pCRT7/CT-TOP-Nt4CL、pET30a-PcPKS5質(zhì)粒作為模板，F(xiàn)1、R1為引物擴增帶有酶切位點EcoRⅠ和中間連接肽3個氨基酸Linker的Nt4CL片段。F2、R2為引物擴增帶有酶切位點XhoⅠ和中間連接肽3個氨基酸Linker的PcPKS5片段。Nt4CL與PcPKS5(濃度比3∶4)混合后做模板，F(xiàn)1、R2為引物，用懸掛PCR技術(shù)將Nt4CL與PcPKS5連接起來，構(gòu)建融合基因Nt4CL-PcPKS5。PCR擴增體系(50 μL)：5 μL 2.5 mmol/L dNTPs,1 μL 10 ng/μL模板，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，1 μL Trans StartTMFastPfu DNA聚合酶，10 μL 5×Trans StartTMFastPfu緩沖液，加ddH2O至終體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃ 20 s，62℃ 20 s，72℃ 30 s，共循環(huán)35次；72℃延伸5 min。產(chǎn)物與pMD18T-Vector連接，轉(zhuǎn)化至DH5α，在含氨芐抗生素的X-Gal/IPTG/LB平板上篩選陽性克隆菌，進一步擴大培養(yǎng)，提取pMD18T-Nt4CL-PcPKS5重組質(zhì)粒。EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，并測序。

表1　懸掛PCR引物序列

注：F1中下劃線為引入的EcoR I位點，R2中下劃線為引入的XhoI位點，R1、F2中下劃線為引入的3個氨基酸序列。

1.4Nt4CL-PcPKS5基因原核表達載體構(gòu)建

分別提取測序正確的重組質(zhì)粒pMD18T-Nt4CL-PcPKS5和pET30a質(zhì)粒，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒，回收Nt4CL-PcPKS5片段和線性pET30a，用T4 DNA連接酶連接片段與線性載體，構(gòu)建pET30a-Nt4CL-PcPKS5重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板篩選。菌液PCR鑒定，進一步提取重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒pET30a-Nt4CL-PcPKS5轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株Rosetta。用含有50 μg/mL的卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的雙抗LB平板篩選陽性菌株，用于下一步融合蛋白的表達。

1.5融合基因的原核表達與純化

篩選含有目的基因重組質(zhì)粒pET30a-Nt4CL-PcPKS5的Rosetta陽性菌株，劃線培養(yǎng)，挑單菌落于50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的LB液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對起始菌液OD600值(0.2、0.4、0.6、0.8)、IPTG終濃度(0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L)、誘導(dǎo)溫度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)和表達時間(2 h、4 h、6 h、8 h、10 h)等條件進行篩選，找出融合蛋白表達的最適條件，并在此條件下進行大量表達。細胞破碎后，用Ni2+親和柱純化，PD-10柱脫鹽，SDS-PAGE檢測。純化蛋白于-80℃保存，用于體外酶促反應(yīng)檢測其催化活性。

1.6體外酶促反應(yīng)與產(chǎn)物檢測

選擇0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液作為體外酶促反應(yīng)的緩沖液。300 μL標準體外酶促反應(yīng)體系含有150 μmol/L 4-香豆酸、280 μmol/L丙二酰輔酶A、250 μmol/L ATP、100 μmol/L CoA以及2.0 μg純化后融合蛋白Nt4CL-PcPKS5。上述反應(yīng)體系分別在不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)緩沖液和不同溫度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)條件下反應(yīng)30 min，加入15 μL乙酸來檢測副產(chǎn)物，加入等體積乙酸乙酯萃取，10 000 r/min、10 min離心，重復(fù)兩次以上，富集上述乙酸乙酯層萃取液，待揮發(fā)干燥后加入1 mL色譜甲醇過有機相濾膜，再次揮發(fā)干燥后加入50 μL 50%(V/V)甲醇溶解，HPLC進行檢測。

選用SunfireTMC18反相柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm)的Waters HPLC系統(tǒng)檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物。選甲醇(A)和水(B)作為流動相，流速設(shè)置為0.8 mL/min，設(shè)定梯度洗脫條件：10%~70% A 30 min，70% A 10 min。白藜蘆醇的標準品溶于色譜甲醇后HPLC檢測其保留時間，白藜蘆醇最大吸收波長為306 nm。

2結(jié)果與分析

2.1Nt4CL-PcPKS5融合基因的克隆

以引物F1和R1為組合、以pCRT7/CT-TOPO-Nt4CL質(zhì)粒為模板來擴增Nt4CL基因，片段大小為1 200 bp (圖1A)，組合引物F2和R2以pET30a-PcPKS5質(zhì)粒為模板來擴增PcPKS5基因，片段大小為1 600 bp(圖1A)。這樣在Nt4CL的3′端和PcPKS5的5′端引入3個氨基酸(GGS)的Linker，Nt4CL3′端與PcPKS5 5′端的重復(fù)序列用于基因融合。回收目的片段，并按比例混合(Nt4CL∶PcPKS5=3∶4),以此為模板，F(xiàn)1和R2為引物組合，運用懸掛PCR技術(shù)，擴增Nt4CL-PcPKS5融合基因，電泳檢測片段約2 800 bp(圖1B)，與理論Nt4CL-PcPKS5融合基因片段大小相符，連接Nt4CL-PcPKS5融合基因片段至pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取pMD18-T-Nt4CL-PcPKS5重組質(zhì)粒，測序結(jié)果表明融合基因構(gòu)建正確。

圖1　Nt4CL、PcPKS5和Nt4CL-PcPKS5基因PCR擴增電泳圖Fig.1　PCR amplification of Nt4CL, PcPKS5 and Nt4CL-PcPKS5 genes.注：A： Nt4CL和PcPKS5基因擴增電泳圖。M：250 bp DNA ladder marker; 1~3：Nt4CL基因；4~6：PcPKS5基因；B：Nt4CL-PcPKS5融合基因電泳圖。M：250 bp DNA ladder marker; 1：Nt4CL-PcPKS5融合基因。

2.2Nt4CL-PcPKS5的表達與純化

將測序正確的表達載體pET30a-Nt4CL-PcPKS5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株Rosetta中，用于融合蛋白的表達。劃線培養(yǎng)pET30a-Nt4CL-PcPKS5，在含有卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中多次活化菌株，外源添加蛋白表達誘導(dǎo)劑IPTG對目標蛋白進行誘導(dǎo)表達條件篩選。當(dāng)菌液OD600值在0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG，25℃誘導(dǎo)表達4 h時，融合蛋白的表達量達到最大。選取最適表達條件進行大量表達，收集菌體，超聲破碎細胞，經(jīng)Ni2+柱純化、PD-10柱脫鹽得到Nt4CL-PcPKS5融合蛋白，聚丙烯酰胺電泳檢測(圖2)，融合蛋白的分子量約為100 kDa，與預(yù)測蛋白分子量大小相符。

2.3融合酶體外酶促反應(yīng)條件篩選

分別研究了反應(yīng)緩沖液pH和反應(yīng)溫度對Nt4CL-PcPKS5融合酶體外酶促反應(yīng)的影響。Nt4CL-PcPKS5融合酶的催化效率隨pH不斷提高呈先升后降的趨勢，最適pH為6.5(圖3A)。反應(yīng)溫度對Nt4CL-PcPKS5融合酶催化效率的影響趨勢同pH，隨著溫度的升高融合酶的催化效率先升后降，最適反應(yīng)溫度為45℃(圖3B)。

圖2　融合蛋白Nt4CL-PcPKS5 SDS-PAGE電泳圖Fig.2　SDS-PAGE analyses of Nt4CL-PcPKS5 fusion protein.注：M:Protein RluerTM IV Marker; 1:Ni2+樹脂親和柱純化蛋白；2~4：PD-10柱脫鹽后的蛋白。

2.4融合酶功能鑒定

白藜蘆醇標準品高效液相色譜(HPLC)檢測結(jié)果如圖4A所示。純化獲得的Nt4CL-PcPKS5融合蛋白在最適條件下催化4-香豆酸和丙二酰輔酶A，生成產(chǎn)物的HPLC檢測結(jié)果如圖4B所示。反應(yīng)產(chǎn)物與白藜蘆醇標準品混合后進行共色譜檢測，結(jié)果如圖4C所示。進一步證實Nt4CL-PcPKS5融合蛋白能有效催化白藜蘆醇合成，表明Nt4CL-PcPKS5融合蛋白具有4CL和STS雙重活性。

圖3　融合酶體外酶促反應(yīng)的最適條件Fig.3　Optimal conditions of fusion enzyme enzymatic reaction in vitroA：融合酶體外酶促反應(yīng)pH曲線；B：融合酶體外酶促反應(yīng)溫度曲線。

圖4　融合蛋白體外酶促產(chǎn)物高效液相色譜圖Fig.4　HPLC analysis of fusion enzyme reaction product in vitro enzymatic.A：白藜蘆醇標準品HPLC圖；B：融合蛋白體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物HPLC圖；C：融合蛋白體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物與白藜蘆醇標準品共色譜圖；箭頭所指均為白藜蘆醇。

3討論

白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗氧化、保護心血管、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等多種生物功能活性[15，16]，利用微生物工程提高白藜蘆醇產(chǎn)量備受研究者的關(guān)注。Becker等[17]將楊樹(Populus)輔酶A連接酶基因(4CL216)和白藜蘆醇合酶基因(vst1)共轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，添加4-香豆酸前體，得到1.5 μg/L白藜蘆醇。同樣，Watts等[18]將擬南芥(Arabidopsisthaliana)4CL與花生(Arachishypogaea)STS基因轉(zhuǎn)化至代謝工程大腸桿菌(JM109)，在添加底物4-香豆酸的情況下生成白藜蘆醇的量超過了100 mg/L。而將來自被修飾的紫草(Lithospermumerythrorhizon)4CL基因和花生STS基因轉(zhuǎn)化至同一株大腸桿菌(JM109)時，白藜蘆醇產(chǎn)量達到171 mg/L[19]。進一步揭示了來自不同物種的4CL與STS融合基因的催化活性有著顯著的差別。研究發(fā)現(xiàn)，虎杖(Polygonumcuspidatum)是已知白藜蘆醇含量最高的植物[20]。在同一催化體系下，虎杖STS催化效率(Kcat/Km)是葡萄STS的2.4倍[21]。Robison[22]將G、S、T組成不同長度的Linker來研究其對蛋白活性的影響，結(jié)果表明Linker的長度不同會影響融合蛋白的活性，氨基酸長度≥13時具有野生型生物活性，當(dāng)長度比較短時只具有部分或不具有生物學(xué)活性。

本研究將煙草4CL與較高活性虎杖STS基因通過3個氨基酸長度的Linker連接，并在原核表達系統(tǒng)中表達，融合酶在體外酶促反應(yīng)中能有效催化4-香豆酸與丙二酰輔酶A生成白藜蘆醇，有利的證實了融合蛋白Nt4CL-PcPKS5同時具有4CL和STS的雙重活性。Zhang等[10]將擬南芥4CL與葡萄(Vitisvinifera)STS兩個酶基因融合，獲得融合基因At4CL-VvSTS，構(gòu)建融合基因表達載體，轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌WAT11，得到的白藜蘆醇表達量高達5.25 μg/mL，是共表達At4CL和VvSTS兩個單酶的15倍，這一結(jié)果說明融合酶活性要遠高于單酶活性。Wang等[23]在研究融合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和酶促動力學(xué)中發(fā)現(xiàn)融合酶4CL/STS催化活性高于STS。對于STS的底物4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A而言，融合酶4CL/STS的催化效率(Kcat/Km)較STS相比分別高出2.33倍和1.29 倍。Nt4CL-PcPKS5酶促動力學(xué)，以及構(gòu)成融合蛋白Linker的氨基酸長度和組成類型是否影響融合酶的活性還有待于進一步研究。本研究為利用融合酶基因轉(zhuǎn)化工程菌株生產(chǎn)白藜蘆醇提供了基礎(chǔ)。較單酶轉(zhuǎn)化相比，融合酶的轉(zhuǎn)化可減少表達載體的數(shù)量，從而簡化了代謝途徑。

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Fusion Expression and Functional Analysis ofNicotianatabacumNt4CLandPolygonumcuspidatumPcSTSGene

LIU Wen-bin1, GUO Hui-li2, LIU Huan1, HUANG Li-na2, ZHANG Fen-qiang1, MA Lan-qing2*

1.PlantScienceandTechnologyCollege,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;

2.KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(North),MinistryofAgriculture,CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China

Abstract:4-coumarate coenzyme A ligase (4CL) and stilbene synthase (STS) are two key final rate-limiting enzymes in the resveratrol phenylalanine metabolic synthesis. In this paper, Nicotiana tabacum 4CL and Polygonum cuspidatum PKS5 were fused together by overlap PCR with three amino acids to construct fusion gene Nt4CL-PcPKS5. The fusion gene was subcloned into pET30a, the recombinant plasmid pET30a-Nt4CL-PcPKS5 was analyzed through heterologous expression in Escherichia coli. The expression product was purified with Ni(2+) affinity column and desalted through PD-10 column. The collected target fusion protein was used for enzymatic reaction in vitro. The enzymatic product analysis showed that the fusion protein showed the activities of both 4CL and STS. The final product was resveratrol. The optimum pH and reaction temperature were 6.5 and 45℃. In this study, a bifunctional fusion enzyme catalyzing resveratrol biosynthesis was obtained, which proved a basis for realizing industrial production of resveratrol.

Key words:resveratrol; fusion gene; prokaryotic expression; enzymatic reaction

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.03

作者簡介：劉文彬，碩士研究生，研究方向為果品優(yōu)質(zhì)生態(tài)安全。E-mail: lwb8002@126.com。*通信作者：馬蘭青，教授，研究方向為植物次生代謝分子調(diào)控。E-mail:lqma@bac.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31300620；31370674)；北京市自然科學(xué)基金重點項目(5111001)；北京市教委面上項目(KM201310020002；KM201310020015；KM201110020001；KM201210020009)；北京市屬高校人才強教深化計劃項目(PHR201108279)資助。

收稿日期：2015-12-15; 接受日期：2015-01-07