王海東,　胡　忠

1.徐州生物工程職業(yè)技術學院, 江蘇 徐州 221006;

2.汕頭大學生物系, 廣東 汕頭 515000

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利用宏基因組法篩選新幾丁質酶基因

王海東1,胡忠2*

1.徐州生物工程職業(yè)技術學院, 江蘇 徐州 221006;

2.汕頭大學生物系, 廣東 汕頭 515000

摘要：為了尋找新型幾丁質酶編碼基因，提取了汕頭灣海域海底表層沉積物中微生物的宏基因組，采用PCR-DGGE技術擴增和分離獲得了新型幾丁質酶基因編碼信息。實驗共得到63條幾丁質酶基因片段，其編碼的蛋白序列與NCBI數據庫收錄的序列相似率在41%～97%之間，且大多數在70%以下，只有8條相似率在70%以上，NCBI數據庫中與其相似性最高的幾丁質酶蛋白序列有18個種屬，其中與橙色滑柱菌株 (Herpetosiphon aurantiacus) ATCC 23779的幾丁質酶存在著最高相似性的序列有27條，另外，與未可培養(yǎng)細菌幾丁質酶基因片段相似的有22條，占34.9%，分屬9個種屬。說明汕頭灣表層沉積物中存在多種幾丁質酶編碼基因，其中有很多是尚未研究的，為尋找新型的幾丁質酶編碼基因提供了有力的生物資源。

關鍵詞：汕頭灣；幾丁質酶；DGGE；宏基因組；表層沉積物

海洋環(huán)境中會產生大量的幾丁質沉積，所以降解幾丁質就成了很多海洋細菌必不可少的特性，幾丁質酶基因在海洋細菌中分布十分廣泛，幾丁質編碼基因資源非常豐富，但是99%的微生物都是不可培養(yǎng)的，給獲取幾丁質基因帶來了巨大的困難。采用宏基因組法可以繞過微生物的培養(yǎng)環(huán)節(jié)直接研究所有微生物的基因信息，通常是構建宏基因組文庫，定向篩選獲得目的基因，但是受到文庫容量、篩選方法和克隆表達等因素的限制，存在一定的盲目性，成功幾率較低，本實驗直接提取汕頭灣表層沉積物中微生物的宏基因組，設計引物直接擴增幾丁質酶編碼基因片段，以獲得幾丁質酶的基因信息，以期為尋找新的幾丁質編碼基因提供一個可行的途徑[1,2]。

1材料與方法

1.1材料

汕頭內海海域是一個多元、龐大、復雜的系統(tǒng)，根據海域的污染源頭、水文地質等情況選取了S1~S9共9個站點采集表層沉積物，以期包括微生物幾丁質酶基因最豐富的位置。其中S1為汕頭港附近海域；S2為媽嶼島近內海海域；S3為媽嶼島靠外海海域；S4為汕頭華能電廠附近海域；S5為海軍生活區(qū)附近海域；S6為汕頭集裝箱碼頭附近海域；S7為牛田洋入?？诤Ｓ?；S8為牛田洋養(yǎng)殖區(qū)海域；S9為西溪入?？诤Ｓ?，采集時間為2007年3月，-80℃超低溫冰箱保存。

1.2試劑

OMEGA凝膠回收試劑盒 (USA)購自廣州威佳生物科技有限公司；2×PCRTaqMix購自廣州東盛生物科技有限公司；DNA抽提緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，100 mmol/L Na2EDTA (pH 8.0)，100 mmol/L Na3PO4緩沖液 (pH 8.0)，1.5 mol/L NaCl，1.0%的CTAB[3]。TER緩沖液: (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，RNA酶終濃度20 μg/mL。

1.3方法

1.3.1宏基因組的提取與純化實驗根據已報道的宏基因組提取方法做了一些綜合改進，具體為：稱取表層沉積物樣品5.0 g，加入20 mL DNA抽提緩沖液和溶菌酶20 mg(終濃度1 mg/mL)，37℃，225 r/min消化2 h；加入2 mL 20%(w/V) SDS，65℃水浴15 min，-70℃冰凍15 min，反復凍融3次；加入等體積氯仿:異戊醇(24∶1)，輕輕混勻，9 000 r/min離心15 min，將上層液相移入新的離心管，再抽提一次，上清移入新管；加入等倍體積異丙醇，-20℃放置1 h，4℃ 9 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀用等體積70%乙醇洗2次，溶解于1 mL TER溶液，得宏基因組粗提液，于-20℃保存[4]。粗DNA經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的DNA條帶進行回收，按照OMEGA凝膠回收試劑盒操作手冊進行。

1.3.2酶基因的擴增實驗采用宏基因組為模板，根據18家族幾丁質酶催化區(qū)域保守氨基酸設計的含有GC夾子的兼并引物對酶基因片段進行擴增[5~9]，引物序列：GCchiR 5′-CGCCCGCCG-CGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCC-CAGGCGCCGTAGARRTCRTARSWCA-3′，chiF 5′-CGTGGACATCGACTGGGARTWYCC-3′。反應條件：95℃ 6 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.3.3變性梯度凝膠電泳分析采用美國CBS公司的變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 系統(tǒng)對PCR產物進行分析，以期更直接的獲得有差異的幾丁質酶基因序列。聚丙烯酰胺凝膠的濃度為12%，變性劑梯度范圍為40%～75%，從上至下變性劑的濃度依次遞減，PCR產物加入適量上樣緩沖液(0.1%溴酚藍、0.1%二甲苯胺、20%蔗糖)，總量約25 μL，150 V，60℃電泳約9 h，EB Free Reagent 染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析[10,11]。切下比較清晰的電泳條帶，加20 μL TE緩沖液，搗碎溶出DNA，吸取2 μL作為模板，應用上述引物二次擴增后連接pUC-Tm載體[12]，交由上海英駿生物技術有限公司測序，序列信息提交NCBI進行對比分析。

2結果與分析

2.1宏基因組提取

提取的宏基因組要求片段足夠長，濃度足夠大，以保證最大限度的包含所有微生物的基因信息。實驗提取的汕頭灣表層沉積物的宏基因組呈微黃色，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測 (圖1)，其片段在23 kb左右，基本無托尾現象，說明該提取方法比較溫和，機械剪切作用溫和。提取的9個站點的宏基因組純化后，采用生物分光光度計檢測OD260(λ=260 nm時1 OD=50 μL/mL的dsDNA)、OD280、OD260/OD280的值，結果如表1所示。OD260/OD280在1.7～1.8為最好，太低說明有腐殖質的污染，太高說明有蛋白的污染，本實驗樣品的 OD260/OD280值均接近這個范圍，說明純化后的宏基因組都比較純凈，進一步計算得到各個站點的宏基因組的濃度都比較高，說明實驗提取的宏基因組的完整性、豐度和純度基本滿足進行下一步實驗的要求，但各個站點之間也存在著差異。

圖1　汕頭灣9個站點表層沉積物提取的宏基因組電泳分析Fig.1　Metagenome electrophoresis analysis of surface sediments in Shantou Bay 9 sits.M：λDNA (HindⅢ) marker；1~9分別為S1～S9站點的樣品

S1S2S3S4S5S6S7S8S9OD260/OD2801.711.631.661.771.791.681.791.831.86得率(μg/g)19.316.315.621.317.516.923.416.919.6

2.2幾丁質酶基因保守區(qū)的擴增

提取的9個站點的宏基因組在23 kb左右，符合實驗要求，然后以9個站點的宏基因組為模板，擴增其中的幾丁質酶基因保守序列(圖2)，可以看出各站點的宏基因組均能夠很好的擴增出250 bp左右的目的條帶。

圖2　宏基因組中幾丁質酶基因保守區(qū)擴增電泳圖Fig.2　Amplified chitinase gene conservative region from metagenome.M: Perfect 1kb DNA ladder (SNBC)；1~9分別為S1～S9站點基因擴增樣品

2.3DGGE電泳分析

擴增的幾丁質酶基因片段進行DGGE電泳，由圖3和圖4可以看出各個站點之間的幾丁質酶多樣性差別比較大，其中以站點S6、S7和S8的幾丁質酶最為豐富，可能是因為靠近牛田洋養(yǎng)殖區(qū)海域的緣故。

2.4幾丁質酶基因文庫克隆子序列分析

由圖3和圖4可以看出，第7個站點的條帶最為豐富，以其為基礎回收差異條帶，同時回收其他站點和第7站點相對的差異條帶，二次擴增后連接pUC-Tm載體測序，得到63條幾丁質酶基因序列，分別命名為CHI1~CHI63，其中有55條不同的序列，提交NCBI得到序列號為：EU700197～EU700251。其編碼的蛋白氨基酸序列與NCBI收錄的序列相似率分布在41%～97%之間，且大多數在70%以下，只有8個克隆子的相似率在70%以上，NCBI數據庫中與其相似性最高的幾丁質酶蛋白氨基酸序列有18個種屬，其中與橙色滑柱菌株(Herpetosiphonaurantiacus)ATCC 23779的幾丁質酶存在著最高相似性的序列有27條，與其他14條相似的幾丁質酶基因有類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、解纖維梭菌(Clostridiumcellulolyticum)(厚壁菌門低G+C革蘭氏陽性菌)、嗜麥芽黃單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、嗜水氣單胞菌(γ變形菌門)、鞘酯桿菌(Pedobacter)(擬桿菌門)、線蟲(Caenorhabditisbriggsae) (線形動物)、?？?Nematostellavectensis)(腔腸動物)等的幾丁質酶基因序列[13~15]，另外，未可培養(yǎng)細菌的幾丁質酶基因片段有22條，占到40%，分屬9個種屬，具體如表2所示。

表2　幾丁質酶蛋白序列與數據庫對比信息表

根據所有的蛋白序列信息構建進化關系樹，由圖5所示，可以觀察到所有的序列可以分為3個比較大的組Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，大多數屬于第Ⅲ組。

3討論

利用宏基因組法探索新基因的信息，提取的宏基因組的質量是非常重要的，其直接決定了實驗的成敗[1,2]，本實驗宏基因組的質量能滿足后續(xù)實驗需要。

產幾丁質酶的細菌類群主要集中在β-變形菌、γ-變形菌、革蘭氏陽性菌和古細菌中，γ-變形菌在海洋中的分布非常廣泛，革蘭氏陽性菌分布很少[13~15]。根據已知的幾丁質酶催化區(qū)和結合區(qū)的保守氨基酸可以設計兼并引物，實驗的引物是根據18家族幾丁質酶序列設計兼并引物，結果獲得的序列均屬于18家族，同時，也說明18家族的幾丁質酶基因差異明顯，未可培養(yǎng)微生物中的幾丁質酶與已知的可培養(yǎng)微生物中的幾丁質酶也存在著非常大的差異。

研究過的幾丁質酶基因序列信息有限，不足以設計一對或幾對引物來很好的擴增所有的幾丁質酶編碼基因[1,7]，隨著對幾丁質酶基因研究的深入，獲得幾丁質酶基因保守序列的信息也越來越多，設計一對或者幾對幾丁質酶基因的通用引物來擴增大部分的幾丁質酶基因序列將會成為可能[2,6,16]。

圖5　幾丁質酶蛋白保守序列進化關系Fig.5　Phylogenetic tree based on the chtinase gene conservative protein sequences.

實驗在沉積物中擴增得到了63條幾丁質酶編碼基因片段，分屬18個種屬，與未可培養(yǎng)細菌幾丁質酶基因片段相似的有22條，占到34.9%，分屬9個種屬。說明汕頭灣表層沉積物中存在著差異程度非常高的幾丁質酶編碼基因，并且有很多是未研究的新型基因。同時，說明以宏基因組為載體，用PCR技術分離新的幾丁質酶基因是一種可行的方法[16,17]，繼續(xù)以獲得的新幾丁質酶基因片段信息設計引物擴增出完整的幾丁質酶基因序列將成為可能[18]。

實驗證明以宏基因組為載體，繞過微生物的培養(yǎng)環(huán)節(jié)，直接調取環(huán)境中微生物的基因信息是可行的，也必將成為研究的主要方向，本實驗也嘗試根據新的幾丁質酶基因片段信息設計引物，在宏基因組中直接擴增全新的幾丁質酶基因并克隆表達，目前尚未獲得成功，但這是一個非常值得研究的途徑。未來如果結合cDNA文庫技術、轉錄組學和代謝組學等技術可能會使宏基因組文庫篩選新型基因的技術更加成熟，實用性更強。

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Screening of New Chitinase Genes with Metagenomics

WANG Hai-dong1, HU Zhong2*

1.XuzhouVocationalCollegeofBioengineering,JiangsuXuzhou221006,China;2.DepartmentofBiology,ShantouUniversity,GuangdongShantou515000,China

Abstract:In order to find new chitinease-encoding genes, we extracted metagenome from surface sediments of the Shantou Bay, and amplified 63 chitinase coding gene fragments using PCR-DGGE. Compared these fragments to NCBI records, the similarity ratios were from 41% to 97%. The most similarity ratios were below 70%, only 8 higher than 70%, and there were 18 species in NCBI chitinase records had the highest similarity ratios. 27 fragments had the highest similarity ratios to the chitinase sequence of Herpetosiphon aurantiacus ATCC 23779. 22 fragments had the highest similarity ratios to uncultured bacteria chitinase sequences which belonged to 9 different species, accounted for 34.9%. The results suggested that there were many different chitinase-coding genes in Shantou Bay sediments, most of them hadn’t yet been studied from now. The paper provided a biological resources for finding new chitinease-encoding genes.

Key words:Shantou Bay; chitinase; DGGE; metagenome; surface sediment

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.07

作者簡介：王海東，碩士研究生，研究方向為生物技術。E-mial: wanghaidong6@163.com。*通信作者：胡忠，教授，博士生導師，研究方向為生物技術。 E-mail:hzh@stu.edu.cn

收稿日期：2015-08-14; 接受日期：2015-09-15