張寶琦， 張 琳， 關(guān)舒丹， 趙 龍， 楊 波， 陳 賓(.承　德　醫(yī)　學(xué)　院　附　屬　醫(yī)　院， 河北 承德 067000 .承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所， 河北 承德 067000 .承德醫(yī)學(xué)院社會(huì)科學(xué)部美育教研室， 河北 承德 067000)

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熱回流提取法測(cè)定不同產(chǎn)地角茴香中總生物堿的含量

張寶琦1， 張 琳2， 關(guān)舒丹3， 趙 龍1， 楊 波1， 陳 賓1
(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所， 河北 承德 067000 3.承德醫(yī)學(xué)院社會(huì)科學(xué)部美育教研室， 河北 承德 067000)

【摘 要】目的:確定熱回流法提取角茴香中總生物堿的最佳提取工藝，并測(cè)定不同產(chǎn)地角茴香中總生物堿的含量，為角茴香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。方法:采用酸性染料比色法測(cè)定不同產(chǎn)地的角茴香中總生物堿的含量，通過(guò)正交設(shè)計(jì)方法，以總生物堿的得率為考察指標(biāo)，優(yōu)選總生物堿的提取工藝。結(jié)果:最終確定總生物堿的最佳提取工藝為:用0.01moL/ L的鹽酸熱回流提取4次，每次2h，料液比為1:20。結(jié)果表明，2014年采自青海湟中的角茴香中所含生物堿含量最高，2015年采自青海大通的含量最低。結(jié)論:不同產(chǎn)地的角茴香中總生物堿的含量差異較大。通過(guò)優(yōu)選得到的提取工藝提高了生物堿的提取效率，可做為今后角茴香中總生物堿的提取工藝。建立的角茴香中總生物堿含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

【關(guān)鍵詞】角茴香； 總生物堿； 熱回流提取法； 含量測(cè)定

角茴香(Hypecoum erectum L.)又名山黃連、野茴香，為罌粟科(Papaveraceae)植物直立角茴香的根或全草[1]，生于干燥山坡、草地、沙地、礫質(zhì)碎石地[2]。產(chǎn)于內(nèi)蒙古、河北、青海、山西、新疆、西藏等地。春季開(kāi)花前挖根及全草，曬干。具有良好的清熱解毒，鎮(zhèn)咳止痛等藥理作用[3，4]。其主要化學(xué)成分是生物堿類化合物[5]，全草含角茴香堿(hypecorine)，角茴香酮堿(hypecorinine)，原阿片堿(protopine)，黃連堿(coptisine)，隱品堿(cryptopine)、α-別隱品堿(α-allocryptopine)，別隱品堿(allocryptopine)，刻葉紫堇胺(corydamine)，左旋的N-甲基四氧小檗堿(N-methylcanadine)，直立角茴香堿(hyperectine)，異直立角茵香堿(isohyperectine)等。韋佩濤[6]采用超聲輔助提取細(xì)果角茴香中總生物堿，并考察了細(xì)果角茴香總生物堿的抑菌活性。蘇銀芬[7]等采用柱層析、薄層層析、薄層制備以及重結(jié)晶等現(xiàn)代化學(xué)分離純化技術(shù)，核磁共振、質(zhì)譜等波譜解析技術(shù)對(duì)角茴香地上部的生物堿進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，從角茴香地上部分離純化得到了7個(gè)生物堿，并測(cè)定了其抑菌活性。但通過(guò)熱回流提取法對(duì)角茴香總生物堿的提取工藝及含量測(cè)定目前沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，本文采用熱回流提取法對(duì)角茴香總生物堿進(jìn)行提取，并通過(guò)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)選擇最佳提取工藝，同時(shí)采用酸性染料比色法對(duì)其進(jìn)行了含量測(cè)定，并對(duì)六個(gè)不同產(chǎn)地角茴香中的生物堿含量進(jìn)行了分析，以期為今后角茴香中的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 儀器:AG-245電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Hp-8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(惠普公司)；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海普渡生化科技有限公司)；H.H.S21.6電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械三廠)。

1.1.2 試劑:溴甲酚綠(化學(xué)純，購(gòu)買(mǎi)于天津化學(xué)試劑研究所)；罌粟堿(對(duì)照品，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為98.8%)；氯仿(化學(xué)純，購(gòu)買(mǎi)于天津市鑫源化工有限公司)；苯二甲酸氫鉀(分析純，購(gòu)買(mǎi)于天津市福晨化學(xué)試劑廠)；其它試劑均為分析純。

1.1.3 藥材:角茴香植物:2014年采自青海省湟中；2014年采自青海省互助，2014年采自青海省湟源，2015年采自青海省大通寶庫(kù)，2015年采自青海省貴德，2015年采自青海省祁連。經(jīng)由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所趙春穎副研究員鑒定為鑒定為罌粟科角茴香屬角茴香(Hypecoum erectum L.)，樣品自然風(fēng)干，粉碎備用。

1.2 方 法

1.2.1 提取方法:精確稱取粉碎后的角茴香2g于圓底燒瓶中，用0.01moL/ L的鹽酸，加熱回流提取。得提取液，抽濾。然后用5%的碳酸鈉溶液調(diào)PH至9～10。再用氯仿反復(fù)萃取，揮干氯仿，最后用10mL的0. 01moL/ L鹽酸溶解，定容，即得供試液。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn):選擇料液比(A)，提取時(shí)間(B)，提取次數(shù)(C)為考查因素，以總生物堿含量(mg/ g)為測(cè)定指標(biāo)，用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)方法，確定角茴香中總生物堿提取的最佳工藝(見(jiàn)表1)。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.3 含量測(cè)定

1.2.3.1 罌粟堿對(duì)照液的制備:精密稱取干燥恒重的罌粟堿對(duì)照品，用0.01moL/ L的鹽酸溶液溶解并定容至5mL，搖勻，再精密移取該溶液2.5mL用0.01moL/ L的鹽酸溶液定容至10mL的容量瓶中，搖勻，即得濃度為50μg/ mL的罌粟堿對(duì)照液。

1.2.3.2 緩沖溶液的配制:取0.2moL/ L苯二甲酸氫鉀溶液25mL與0.2moL/ L的鹽酸溶液10.2mL混合于100mL容量瓶中，定容，搖勻，即得PH = 3的緩沖溶液。

1.2.3.3 酸性染料比色原理及溶液的配制:酸性染料比色法是利用某些酸性染料在一定PH條件下可與堿性藥物結(jié)合，定量形成有色離子對(duì)，并定量被有機(jī)溶劑提取，然后用比色法測(cè)定其含量。取溴甲酚綠0.1g，加0.05moL/ L氫氧化鈉溶液3.0mL使溶解，加水稀釋至200mL，搖勻，即得。

1.2.3.4 吸收曲線的繪制:用移液管準(zhǔn)確移取罌粟堿對(duì)照溶液1.2mL，按1.2.3.3項(xiàng)下方法用分光光度計(jì)在250～550nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度的測(cè)定，結(jié)果在415nm處有最大吸收峰，故以此作為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:吸取罌粟堿對(duì)照液0.4、0. 8、1.2、1.6、2.0mL分別置于分液漏斗中，加PH=3的緩沖溶液5.0mL、溴甲酚綠2.0mL，搖勻，再加氯仿溶液16mL，充分振搖，靜置1h，分取氯仿層測(cè)定吸光度，以0.01moL/ L鹽酸1mL同法做空白對(duì)照。以罌粟堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪圖，求得回歸方程:y= 0. 0817x-0.0357，R=0.9998。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.3.6 供試品中總生物堿的含量測(cè)定:按最優(yōu)組合提取，得到供試液，精密移取各供試液0.2mL，按照1. 2.3.5項(xiàng)下方法，在波長(zhǎng)415nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程求得總生物堿含量。

2 結(jié) 果

2.1 正交試驗(yàn):從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表可知，7號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好，對(duì)應(yīng)的最優(yōu)組合為A3B1C3；由極差R分析可知，總生物堿提取條件因素的順序?yàn)锳>B>C。由正交條件的均勻可比性得知，各因素的最優(yōu)水平組合為A3B2C3，即料液比1∶20，提取時(shí)間2h，提取次數(shù)4次。在此最佳條件下的驗(yàn)證性試驗(yàn)測(cè)得總生物堿含量為4. 00mg/ g。因此，采用熱回流提取法，最終確定的最佳提取條件為:料液比1∶20，提取時(shí)間2h，提取次數(shù)4次。

2.2 含量測(cè)定:按最終確定的最佳提取條件，即最優(yōu)組合A3B2C3進(jìn)行提取，分別對(duì)不同產(chǎn)地角茴香中總生物堿含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　不同產(chǎn)地角茴香總生物堿含量

結(jié)果顯示，其中總生物堿含量高低依次為14年采自青海省湟中，14年采自青海省互助，14年采自青海省湟源，15年采自青海省祁連，15年采自青海省貴德，15年采自青海省大通寶庫(kù)。

3 討 論

角茴香喜溫暖、潮濕氣候，產(chǎn)區(qū)多在北緯25度以南，年降水量需1000mm以上，相對(duì)濕度在80%以上。幼樹(shù)喜蔭，成年樹(shù)喜光。忌強(qiáng)光和干旱，怕強(qiáng)風(fēng)。以土層深厚、疏松、腐殖質(zhì)含量豐富、排水良好的偏酸性的壤土或砂質(zhì)壤土栽培為宜。而本研究藥材采收之地:青海湟中、青?；ブ?、青海湟源、青海祁連、青海貴德、青海大通在溫度、濕度、氣候、土壤質(zhì)地均有不同，同時(shí)，六批藥材分別采收于兩年的同一采收期，但每年各地的氣候也存在一定差異。這些因素都導(dǎo)致六批角茴香藥材中總生物堿的含量有所差別。角茴香在臨床中應(yīng)用廣泛、療效可靠。本文通過(guò)優(yōu)選所得到的提取工藝提高了角茴香生物堿的提取效率，同時(shí)建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可做為今后角茴香中總生物堿的提取工藝并進(jìn)行含量測(cè)定。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志[M].青海:人民出版社，1991.248.

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[6] 韋佩濤.細(xì)果角茴香生物堿最低抑菌濃度測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(27):10986～10988.

[7] 蘇銀芬.角茴香地上部生物堿及其抑菌活性研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

The Application of Heat reflux Extraction to Determine the Contents of Total Alkaloids in Erect Hypecoum Herb from Different Origins

ZHANG Baoqi， et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Hebei Chengde 067000，China)

【Abstract】Objective: To make sure that the optimum extraction technology of total alkaloids in erect hypecoum herb was heat reflux extraction method，to determine the contents of total alkaloids in erect hypecoum herb from different origins，and to provide a certain basis for the quality standard of hypecoum. Methods: The contents of total alkaloids in erect hypecoum herb from different origins were tested with acid dye colorimetry. By orthogonal design method，the yield of total alkaloids was referred as the index of evaluation tobook=638,ebook=114optimize its extraction process. Results: The optimum extraction technology of total alkaloid was finally that it was extracted 4 times with 0.01 moL/ L hydrochloric acid(HC) through the method of heat reflux，2 hours for each time，with material to solvent 1∶20. The results showed that the highest contents of total alkaloids in erect hypecoum herb collected from Huangzhong area of Qinghai Province in 2014，and the lowest from Datong area of Qinghai in 2015. Conclusion: There's a significant difference about the contents of total alkaloids in erect hypecoum herb from different origins. The optimized extraction process improved the extraction efficiency of alkaloid. And this method could be used as the extraction technology of total alkaloid from erect hypecoum herb in the future due to its simpleness，accurateness and reliability.

【Key words】Erect hypecoum herb； Total alkaloids； Heat reflux extraction； Content determination

通訊作者:陳 賓，E-mail:drchenbin@ vip.sina.com

【基金項(xiàng)目】河北省教育廳2015年省級(jí)研究生創(chuàng)新資助項(xiàng)目，(編號(hào):z2015052323)；國(guó)家自然科學(xué)基金，(編號(hào):81502334)；國(guó)家衛(wèi)計(jì)委吳階平專項(xiàng)基金，(編號(hào):320.6750.14119)；河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目，(編號(hào):ZL20140116)

【文章編號(hào)】1006-6233(2016)04-0637-04

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【doi】10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.04.042