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甘露聚糖結(jié)合凝集素對白假絲酵母菌相態(tài)轉(zhuǎn)化的影響及機制研究

宋家政1，高春海2

(1.蘭陵縣人民醫(yī)院，山東 蘭陵277799；2.臨沂市人民醫(yī)院 檢驗科)

白假絲酵母菌(Candidaalbicans，C.albicans)俗名白色念珠菌，是一種條件致病菌，廣泛存在于人的口腔、上呼吸道、皮膚、腸道及陰道黏膜，是一種正常菌群，但當(dāng)機體免疫力低下或菌群失調(diào)時，C.albicans 即是一種條件致病菌，當(dāng)發(fā)生感染時，C.albicans 就完成不同的菌相轉(zhuǎn)化，白假絲酵母菌就酵母相(Yeastform，Y)向菌絲相(Hyphalform，H)進行轉(zhuǎn)化，菌絲相酵母菌是造成感染的關(guān)鍵因素，有學(xué)者研究顯示菌相轉(zhuǎn)化與念珠菌感染之間存在明顯的相關(guān)性[1]，白假絲酵母菌菌相轉(zhuǎn)化需要一定的物理化學(xué)劑免疫調(diào)節(jié)分子的調(diào)節(jié)才能有效的完成轉(zhuǎn)化，相關(guān)物理化學(xué)條件研究較多，而對于免疫分子研究相對較少。

甘露聚糖結(jié)合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)是一種存在于血漿中天然免疫調(diào)節(jié)因子，主要由肝細(xì)胞分泌[2]，近年來的報道顯示甘露聚糖結(jié)合凝集素對機體的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用[3-4]。本研究探討甘露聚糖結(jié)合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)對白假絲酵母菌(Candida albicans，C.albicans)菌相態(tài)轉(zhuǎn)化的影響及相關(guān)調(diào)節(jié)機制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

試驗所用試劑牛FITC、牛血清白蛋白、胰蛋白胨、瓊脂糖及胰蛋白酶均購自 Sigma公司，酵母提取物購自Gibco 公司，所用檢測儀器有流式細(xì)胞儀為美國 BD公司生產(chǎn)，倒置相差顯微鏡型號為TS100，為日本Nikon公司生產(chǎn)，核酸蛋白分析儀為德國Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1人甘露聚糖結(jié)合凝集素(Mannan-bindinglectin，MBL)的制備 具體操作步驟為1 mol/L CaCl2加入到新鮮冰凍人血漿1 000 ml，使其終濃度為20 mmol/L，37 ℃水浴2 h后4 ℃過夜，低溫離心機離心沉淀20 min，棄上清液取沉淀經(jīng)過濾過、洗柱、超濾、離心等操作制備純化 MBL。

1.2.2C.albicans培養(yǎng) 采用常規(guī)方法將C.albicans 標(biāo)準(zhǔn)菌株置于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)16 h后傳代1次，在RPMI1640培養(yǎng)基上將傳代培養(yǎng)物懸浮，濃度調(diào)整為5×107個/ml，行100 μl MBL(10 mg/L)處理的設(shè)為研究組，未行MBL處理的設(shè)為對照組，兩組均置于37℃200 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)；間隔2 h觀察C.albicans 菌絲形成情況，剩余的菌懸浮液進行RNA提取。

1.2.3FITC-MBL的制備采用透析法制備FITC標(biāo)記MBL，具體操作方法:將MBL置于pH9.6的碳酸鹽緩沖液進行透析過夜，用二甲基亞砜(DMSO)將FITC溶解并調(diào)節(jié)其濃度至1 mg/ml，根據(jù)比例在MBL蛋白溶液中滴入FITC-DMSO溶液，F(xiàn)ITC/MBL=50 μg FITC/mgMBL，標(biāo)記物中加入PBS溶液調(diào)節(jié)至2.5 mL，在室溫避光條件下用磁力攪拌器攪拌2 h，4℃透析過夜，MBL終濃度調(diào)節(jié)至10 mg/mL。

1.2.4C.albicans與FITC-MBL結(jié)合試驗將C.albicans置于Ca2+濃度分別為 1 mmol/L 、5 mmol/L的緩沖液或者EDTA液中，調(diào)整C.albicans菌液濃度為5×109個/L， 將濃度為10 mg/L的FITC-MBL加入到200 μl C.albicans菌液中， 并置于37℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)半小時后用PBS 充分洗滌，未見FITC標(biāo)記的MBL作為陰性對照組，各管加入200 μl流式洗液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5C.albicans HWP1、DDR 48mRNA的表達檢測首先提取C.albicans RNA，取研究組和對照組C.albicans 1×107個，根據(jù)Yeast RNAiso Kit 說明書提取RNA，用核酸蛋白分析儀測定提取的RNA的濃度及A260 nm/A280 nm 比值來判定RNA的純度及完整性，當(dāng)260 nm/A280 nm>1.8時，說明提取的RNA的純度及完整性較高。根據(jù)情況將RNA的濃度調(diào)整為0.20 mg/ml。其次反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，HWP1、DDR48 和β-actin引物合成是由公司合成(具體見表1)，分別提取的研究組和對照組C.albicans RNA 各1 μg，加入到反應(yīng)體系中，使總反應(yīng)體積在20 μL，首先37℃條件下，反應(yīng)15 min合成 cDNA 第一鏈， 85℃條件下滅活反轉(zhuǎn)錄酶后終止反應(yīng)，4℃條件下復(fù)性。最后PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系中包括上、下游引物分別為0.8 μL，通過90℃條件下預(yù)變性 30 s，90℃條件下變性5 s，60℃條件下延伸30 s，并經(jīng)過40次循環(huán)后進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，紫外燈下觀察拍照，并用凝膠成像儀分析 DNA 片段的灰度值。

表1　RT-PCR基因引物序列及產(chǎn)物堿基數(shù)

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS17.0 軟件包進行統(tǒng)計處理， 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析方法，P<0.05判定差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組菌相轉(zhuǎn)化比較

從圖1中可以看出研究組經(jīng)過MBL處理后2 h及4 h，C.albicans酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化明顯受到抑制，而在MBL處理8 h后，研究組菌絲生長速度與對照組基本一致。

2.2MBL抑制C.albicans菌相轉(zhuǎn)化的機制研究

本研究結(jié)合試驗結(jié)果顯示，無論是C.albicans的酵母相還是菌絲相，MBL 在不含緩沖液中均不能與C.albicans 結(jié)合，在濃度為5 mmol/L Ca2+的結(jié)合體系中，MBL與C.albicans 結(jié)合能力明顯高于在濃度為1 mmol/L Ca2+的結(jié)合體系中，說明MBL與C.albicans的結(jié)合與結(jié)合緩沖液中Ca2+濃度有明顯相關(guān)性。見圖2。

2.3MBL 對 C.albicans HWP1 、DDR48mRNA 表達的影響

從圖3中可以看出，研究組加入MBL后2 h、4h，PCR擴增產(chǎn)物顯示電泳帶相對較弱，而8 h時，電泳帶明顯增強，說明加入MBL后2 h、4 h，C.albicans HWP1 mRNA 表達明顯減少,而8 h時HWP1mRNA 表達增多，與對照組相比無明顯差異；而對于DDR48 mRNA的表達，在MBL處理的各個時間段，研究組和對照組DDR48 mRNA的表達無明顯差異；DNA片段灰度分析結(jié)果顯示，研究組加入MBL 處理后2 h、4 h，HWP1的灰度值與對照組相比明顯減弱，而在MBL 處理8 h時，HWP1的灰度值與對照組相比無明顯差異，DDR48灰度值在MBL處理后2 h、4 h及8 h與對照組相比無明顯變化，詳見表1。

圖1　倒置顯微鏡下觀察甘露聚糖結(jié)合凝集素抑制

圖2　MBL以Ca2+依賴的形式抑制C.albicans菌相轉(zhuǎn)化

組別HWP1(x1000)2h4h8hDDR48(x1000)2h4h8h研究組2.0±0.33.8±0.57.9±0.62.8±0.23.5±0.54.5±0.3對照組3.9±0.47.3±1.18.1±0.72.5±0.53.3±0.74.3±0.2P<0.05<0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

圖3研究組和對照組C.albicans HWP1 、DDR48mRNA表達比較(+代表研究組，-代表對照組)

3討論

C.albicans 是一種致病真菌，在臨床上較為常見，常駐于人的口腔、上呼吸道、皮膚、腸道及陰道黏膜，是一種正常菌群，但當(dāng)機體免疫力低下或菌群失調(diào)時，C.albicans 即是一種條件致病菌。C.albicans有兩種菌相，即酵母相和菌絲相，因此，又稱二態(tài)性真菌，正常條件下，酵母相真菌無感染性，而菌絲相真菌感染性相對較強，因此，白假絲酵母菌感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)化，在臨床工作中，有效的控制真菌感染的切入點就是阻斷酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化。

甘露聚糖結(jié)合凝集素是一種C.albicans 感染早期肝細(xì)胞合成分泌的急性期蛋白，正常無感染條件下，人血清濃度為0.01-10 mg/L， 在急性期感染條件下，甘露聚糖結(jié)合凝集素在外周血的水平急速增加[5]，因此，甘露聚糖結(jié)合凝集素在感染免疫調(diào)節(jié)機制中起著重要的作用，有學(xué)者研究顯示甘露聚糖結(jié)合凝集素對C.albicans 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有較強的抑制作用[6]。本研究結(jié)果顯示，研究組C.albicans經(jīng)過MBL處理后2 h及4 h，C.albicans酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化明顯受到抑制，而在MBL處理8h后，研究組菌絲生長速度與對照組基本一致，說明在C.albicans 感染早期，加入 MBL處理能夠明顯抑制C.albicans 酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)化，達到抗感染的目的。而MBL是通過什么途徑抑制C.albicans 菌相轉(zhuǎn)化的，值得進一步探討，有學(xué)者[3]研究結(jié)果，Ca2+在C.albicans酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化的過程中起著重要的橋梁作用，本研究通過結(jié)合試驗結(jié)果顯示，無論是C.albicans的酵母相還是菌絲相，MBL 在不含緩沖液中均不能與C.albicans 結(jié)合，而隨著結(jié)合緩沖液中Ca2+濃度升高，MBL 與C.albicans 的結(jié)合呈增強趨勢，說明MBL與C.albicans的結(jié)合與結(jié)合緩沖液中Ca2+濃度有明顯相關(guān)性，可見白假絲酵母菌無論是酵母相還是菌絲相菌體表面可能存在依賴Ca2+的依賴MBL 結(jié)合受體。

HWP1 是一種基因，主要負(fù)責(zé)C.albicans 菌絲胞壁蛋白的編碼，有學(xué)者[7]研究顯示HWP1主要通過編碼甘露糖而與細(xì)胞壁的甘露糖以共價鍵的形式結(jié)合，從而促使C.albicans菌絲形成。本研究RT-PCR結(jié)果顯示研究組加入MBL后2 h、4 h，PCR擴增產(chǎn)物顯示電泳帶相對較弱，而8 h時，電泳帶明顯增強，說明加入MBL后2 h、4 h，C.albicans HWP1 mRNA 表達明顯減少，而8 h時HWP1mRNA 表達增多，與對照組相比無明顯差異；DNA片段灰度分析結(jié)果顯示，研究組加入MBL 處理后2 h、4 h，HWP1的灰度值與對照組相比明顯減弱，而在MBL 處理8 h時，HWP1的灰度值與對照組相比無明顯差異，說明甘露聚糖結(jié)合凝集素在早期能夠有效的抑制白假絲酵母菌菌絲生長，具體機制可能是與抑制HWP1 基因表達有關(guān)。

DDR48 蛋白是白假絲酵母菌形成菌絲和包膜的必需蛋白，有學(xué)者[8]研究顯示白假絲酵母菌形成菌絲和包膜的過程中DDR48 蛋白的表達量明顯增加，另外也是一種損傷反應(yīng)的標(biāo)志，與DNA損傷有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，在MBL處理的各個時間段，研究組和對照組DDR48 mRNA的表達無明顯差異；DNA片段灰度分析結(jié)果顯示，DDR48灰度值在MBL處理后2 h、4 h及8 h與對照組相比無明顯變化，說明甘露聚糖結(jié)合凝集素抑制酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化不是通過DDR48 基因介導(dǎo)的。

總之，甘露聚糖結(jié)合凝集素在C.albicans感染早期能夠依賴Ca2+抑制酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化，具體機制可能是通過減弱調(diào)控基因 HWP1 的表達。

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(收稿日期：2015-03-14)

作者簡介：宋家政(1966-)，男，山東蘭陵人，本科，副主任技師，主要研究方向：血液形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等。

文章編號：1007-4287(2016)03-0368-04