韓圣娜，劉　備，孔　嵐，李　靚，馮　馨，張　衛(wèi)，張莉蓉#

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室 鄭州 450001　2)河南省腫瘤醫(yī)院麻醉科 鄭州 450008　3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州 450052

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依托咪酯對HEK-293細胞中異源表達的hERG鉀通道電流的抑制作用*

韓圣娜1)，劉備1)，孔嵐2)，李靚1)，馮馨1)，張衛(wèi)3)，張莉蓉1)#

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室 鄭州 4500012)河南省腫瘤醫(yī)院麻醉科 鄭州 4500083)鄭州大學第一附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州 450052

關鍵詞依托咪酯；hERG鉀通道；全細胞膜片鉗；HEK-293細胞

摘要目的：觀察依托咪酯對HEK-293細胞中異源表達的hERG鉀通道電流的抑制作用及其機制。方法：采用脂質體瞬時轉染的方法將野生型hERG(WT-hERG)、突變型Y652A-hERG和F656C-hERG分別轉染人胚胎腎細胞HEK-293，應用全細胞膜片鉗技術記錄依托咪酯對轉染后HEK-293細胞表達的hERG鉀通道電流的抑制作用以及對激活曲線和失活曲線的影響。結果：依托咪酯可濃度依賴性地抑制WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流，其半數(shù)最大抑制濃度為(6.41±2.43) μmol/L，對激活曲線和失活曲線無明顯影響。與WT-hERG轉染的HEK-293細胞相比，依托咪酯對突變體Y652A-hERG及F656C-hERG轉染的HEK-293細胞內鉀通道電流的抑制作用減弱。結論：F656C可能是依托咪酯抑制hERG鉀通道的重要靶點。

Inhibition effects of etomidate on hERG K+channel expressed in HEK-293 cells

HANShengna1)，LIUBei1)，KONGLan2)，LILiang1)，F(xiàn)ENGXin1)，ZHANGWei3)，ZHANGLirong1)

1)DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofAnesthesiology，HenanCancerHospital,Zhengzhou4500083)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsetomidate; hERG K+channel; whole-cell patch clamp; HEK-293 cell

AbstractAim: To investigate the molecular mechanisms of etomidate on hERG K+channel expressed in human embryonic kidney(HEK-293) cells.Methods: HEK-293 cells were transfected transiently with different hERG plasmid (WT, mutant Y652A and F656C, respectively) using lipofection. Whole-cell patch clamp technique was used to record the effects of etomidate on hERG K+channel current,and the activation and inactivation curves expressed in HEK-293 cells. Results: Etomidate directly inhibited WT-hERG K+current in a concentration-dependent manner, and half-maximum block concentration was (6.41±2.43)μmol/L. But etomidate did not markedly modify the activation and inactivation curves of WT-hERG K+channel. The inhibition effects of etomidate on mutant Y652A-hERG and F656C-hERG K+channel were attenuated compared with WT-hERG K+channel.Conclusion: F656C may be the key target that etomidate inhibits the hERG K+channel.

長QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是一種嚴重的心律失常，在圍手術期發(fā)生率較高，其表現(xiàn)主要為體表心電圖QT間期延長、ST-T段異常，嚴重者可引發(fā)尖端扭轉型室性心動過速(torsades de pointes，TdP)等惡性心律失常，甚至引起患者暈厥或猝死[1]。QT間期作為心臟安全性的一個重要指標引起越來越多臨床醫(yī)生和藥廠的關注。臨床上由藥物引起的后天獲得性LQTS(acquired long QT syndrome，aLQTS)更為常見，許多心血管藥物和非心血管藥物都可使QT間期延長[2]。這些藥物主要通過抑制參與心肌動作電位復極3期的快速激活延遲整流鉀通道(rapid activating delayed rectifier K+channel，IKr)，造成細胞內K+外流減少，復極時間延長，整個動作電位時程(action potential duration，APD)延長。而編碼IKr通道的基因是hERG(human ether-a-go-go-related gene，hERG)。依托咪酯是一種人工合成的咪唑類衍生物，因其粒子小和分布均勻而具有一定的靶向性，可聯(lián)合應用多種靜脈類或吸入類麻醉藥。依托咪酯對QT間期影響的報道不一：有研究認為依托咪酯不影響QT間期[3]甚至縮短QT 間期[4]，但也有文獻[5]報道依托咪酯可延長QT間期。在這些報道中，依托咪酯一般都和其他藥物同時使用，對機體作用復雜，很難了解依托咪酯單獨對QT間期的作用。因此，為全面了解依托咪酯對心臟不良反應的機制，作者采用全細胞膜片鉗技術觀察依托咪酯對人胚胎腎細胞(human embryonic kidney，HEK-293)上的hERG鉀通道電流的影響及其機制，為臨床麻醉醫(yī)師圍手術期合理用藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1細胞株與質粒HEK-293細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心并由課題組凍存后保存。野生型pcgi-EGFP-WT-hERG質粒由南京師范大學生命科學院張朝教授饋贈，突變型pcgi-EGFP-Y652A-hERG和pcgi-EGFP-F656C-hERG質粒由課題組經PCR定點突變技術而得并保存。

1.2藥品、試劑及相關溶液電極內液：MgCl2·6H2O 1 mmol/L，KCl 140 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，Na2ATP 5 mmol/L；用1 mol/L KOH調pH值至7.2。細胞外液：KCl 5.4 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L， MgCl2·6H2O 1 mmol/L；用1 mol/L的NaOH調pH值至7.3～7.4。高K+的細胞外液：KCl 95 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L；用1 mol/L的NaOH調pH值至7.3～7.4。LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素購自HyClone公司，質粒小提試劑盒購自Axygen公司，2.5 g/L的胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物技有限公司，依托咪酯購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司(溶于DMSO，配成10 mmol/L母液，使用時用細胞外液稀釋配成實驗所需濃度)。其他試劑均為國產分析純。

1.3主要儀器IX-71倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；EPC-10膜片鉗放大器(HEKA公司，德國)；Model P-97電極控制儀(Sutter公司，美國)；PCS-5000三維微電極操縱器(Buleigh公司，美國)等。

1.4HEK-293細胞培養(yǎng)和脂質體瞬時轉染采用含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分數(shù)5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK-293細胞。選用脂質體瞬時轉染的方法將野生型(WT)和突變型(Y652A和F656C)hERG基因分別轉染HEK-293細胞，轉染36～48 h后取出細胞做全細胞膜片鉗記錄。

1.5hERG鉀通道電流的記錄將表達有綠色熒光蛋白(EGFP)的HEK-293細胞置于倒置顯微鏡載物臺上，使用的微電極尖端直徑一般0.5～1.0 μm，充以電極內液后阻抗達2～3 MΩ。高阻封接形成后進行串聯(lián)電阻和電容電流補償，形成全細胞記錄模型。當細胞破膜穩(wěn)定后，給予細胞維持電位-80 mV，去極化電位-40～+70 mV，持續(xù)3 s，復極電位至-40 mV，持續(xù)2 s，刺激間隔為15 s，采樣頻率0.25 kHz。實驗過程由計算機軟件Pulse 8.67完成刺激信號的產生、反饋信號的采集以及數(shù)據分析。用電壓鉗模式進行刺激和記錄hERG鉀通道電流。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行分析。應用配對t檢驗比較加藥前后WT-hERG鉀通道電流的相關參數(shù)V1/2和k的變化，應用兩獨立樣本的t檢驗比較野生型和突變型hERG鉀通道電流抑制率的差異，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1不同濃度依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的抑制作用依托咪酯采用5個濃度(0.001、0.01、0.1、1.0、10和100 μmol/L)，以依托咪酯的對數(shù)濃度(Log μmol/L)為橫坐標，加藥前后的相應電流比值為縱坐標，得藥物抑制WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的量-效關系曲線(圖1)。用Hill公式計算依托咪酯抑制WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的IC50值。Idrug/Icontrol=1/[1+(D/IC50)n]，其中D為藥物的濃度值，IC50值為藥物抑制hERG鉀電流一半時的藥物濃度(IC50)，n為Hill系數(shù)。經Hill公式得出依托咪酯抑制WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的IC50值為(6.41±2.43)μmol/L，Hill系數(shù)為0.37±0.06。

2.2依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的抑制作用見圖2、表1和2。圖2A顯示，加入10 μmol/L依托咪酯4～5 min時電流基本趨于穩(wěn)定，故該實驗均以加藥5 min后作為觀察藥物作用效果的時間點。圖2B顯示的是10 μmol/L依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的抑制作用。表1和表2分別顯示了相應電壓下依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞的時間依賴性電流和尾電流的I-V曲線的影響。

圖1　依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的量效關系曲線

A：同一細胞應用10 μmol/L依托咪酯5 min內鉀通道電流的變化；B：10 μmol/L依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的抑制作用。圖2　10 μmol/L依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的抑制作用

電壓/mV加藥前電流密度(pA/pF)加藥后電流密度(pA/pF)tP-303.70±1.193.47±1.400.2760.791-208.30±2.2316.60±2.120.2760.423-1016.17±3.5811.35±3.190.8380.191024.66±3.9115.89±3.331.4490.0451031.21±3.8019.68±3.322.4400.0022032.52±4.9019.47±3.094.5290.0013029.09±6.5117.45±4.095.1400.0044022.05±7.2214.78±4.244.0550.1615016.08±6.1212.93±4.671.5600.5126010.44±4.757.37±3.960.6840.117706.56±3.894.76±3.361.7770.081

表2　10 μmol/L依托咪酯對轉染的

2.3依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流激活曲線和失活曲線的影響以電壓為橫坐標，相應電壓下的尾電流值與尾電流最大值(一般在+30 mV)的比值為縱坐標作圖，數(shù)據經Boltzman方程擬合，即可得到WT-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線和參數(shù)。Boltzman方程為：I/Imax=1/(1+exp((V1/2-Vm)/k)，式中V1/2為通道達1/2激活時的膜電位，k是當Vm=V1/2時的最大斜率因子。在+20 mV、4 000 ms的去極化之后，給予快速去極化脈沖的刺激，記錄-130～+20 mV電位下的電流，經過Boltzmann方程擬合即可得出穩(wěn)態(tài)失活曲線和參數(shù)(表3)。

2.4依托咪酯對Y652A-hERG和F656C-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的作用見圖3、4和表4、5。由圖4可知，10 μmol/L的依托咪酯對

WT-hERG和Y652A-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流均有抑制作用，而Y652A的突變削弱了10 μmol/L依托咪酯對hERG電流的抑制作用。由于F656C-hERG鉀通道具有細胞膜低表達的特點，用正常細胞外液不易引出外向尾電流，實驗中采用含高鉀的細胞外液(K+95 mmol/L)，先給予細胞一個+20 mV的去極化脈沖，隨后將細胞復極至-120 mV，引出其內向尾電流，圖4顯示了在高鉀細胞外液下10 μmol/L的依托咪酯分別作用于WT-hERG和F656C-hERG轉染的HEK-293細胞鉀通道電流的變化。

表3　依托咪酯對WT-hERG轉染的HEK-293

圖3　依托咪酯對Y652A-hERG轉染的HEK-293細胞鉀電流的抑制作用

圖4　依托咪酯對F656C-hERG轉染的HEK-293細胞鉀電流的抑制作用

%

表5　依托咪酯對野生型和突變型F656C-hERG

3討論

有文獻[6]報道，麻醉維持期間依托咪酯的血漿藥物濃度為1.23～2.05 μmol/L，鎮(zhèn)靜濃度為0.61～1.23 μmol/L，清醒時0.61～1.02 μmol/L。該實驗結果顯示依托咪酯能濃度依賴性的抑制hERG鉀通道電流，其IC50值為(6.41±2.43)μmol/L，高于依托咪酯正常使用劑量下的血藥濃度，這說明在正常劑量下使用依托咪酯，是比較安全的，但是當依托咪酯使用劑量過大時，其臨床血藥濃度升高會有發(fā)生QT間期延長的潛在危險，這是值得麻醉醫(yī)生提高警惕注意的問題。

隨之，該實驗又探討了依托咪酯能夠抑制hERG鉀通道的分子機制。在hERG鉀通道的6個跨膜區(qū)域(S1-S6)中，S6區(qū)的氨基酸殘基是很多藥物保守結合位點，其中652位置的酪氨酸(Y652)和656位置的苯丙氨酸(F656)是藥物的主要結合位點[7]。為了進一步了解依托咪酯抑制WT-hERG鉀通道的機制是否與Y652和F656有關，作者觀察了依托咪酯對Y652A(第652位酪氨酸突變?yōu)楸彼?和F656C(第656位苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?突變體的阻滯作用。選用的依托咪酯的濃度為10和100 μmol/L(超過依托咪酯抑制WT-hERG鉀通道的IC50的1.5和15.0倍)，觀察高濃度的依托咪酯是否能夠抑制突變后的hERG鉀通道電流，結果顯示Y652A突變削弱了10 μmol/L依托咪酯阻斷hERG鉀通道的能力(約2倍)，而當依托咪酯為100 μmol/L時，其對WT和Y652A抑制的程度差異無統(tǒng)計學意義。F656C突變后，與野生型相比，依托咪酯(10和100 μmol/L)分別抑制hERG鉀通道電流的程度減弱3.56和3.64倍，相比而言F656可能是依托咪酯阻斷hERG鉀通道的關鍵結合位點。

雖然依托咪酯以對心血管影響較小的優(yōu)勢而在臨床應用廣泛，但是通過該實驗證實，依托咪酯能夠阻斷hERG鉀通道，在使用濃度較高時仍有發(fā)生QT間期延長的潛在危險。另一方面，圍手術期發(fā)生LQTS的因素除與麻醉藥物本身有關外，還受到很多因素的影響。QT間期是反映心肌復極時程的一個重要指標，是一個動態(tài)的生理變數(shù)，受多種因素如年齡、性別、心率、活動狀態(tài)、藥物和電解質濃度、患者本身疾病等的影響。手術本身也是造成QT間期延長的危險因素，如麻醉誘導期喉鏡和氣管插管刺激可使交感神經興奮；引起QT間期延長；手術操作刺激和牽拉也可反射性地引起迷走神經興奮，導致心率減慢，使QT間期延長。

綜上所述，患者圍手術期出現(xiàn)QT間期延長，往往是多種因素相互作用的結果，提醒麻醉醫(yī)生應認真分析原因，高度警惕引起QT間期延長的潛在因素，做全面的圍術期風險評估，針對不同體質的患者選擇合適的藥物，盡量避免心臟不良反應的發(fā)生。

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中圖分類號R322.1；R978.1

#通信作者，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向：藥物不良反應，E-mail：zhanglirongzzu@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.017

*國家自然科學基金青年基金項目81200138