楊紅巖，才讓卓瑪，唐　煜，馮海霞，張　瑩，蔡傳勇，常運(yùn)朝，車團(tuán)結(jié)*

（1.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州　730030；2.甘肅省生物芯片工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州　730030；3.甘肅省功能基因組與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州　730030）

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顯色培養(yǎng)基在飼料沙門氏菌檢測中的應(yīng)用

楊紅巖1，才讓卓瑪1，唐煜1，馮海霞2，張瑩2，蔡傳勇3，常運(yùn)朝2，車團(tuán)結(jié)3*

（1.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州730030；2.甘肅省生物芯片工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州730030；3.甘肅省功能基因組與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730030）

摘要：研究旨在探討沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在飼料微生物檢測中的應(yīng)用。利用氯化鎂-孔雀綠增菌液和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液增菌后，利用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基對60份飼料樣品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測。傳統(tǒng)檢測方法確定，飼料中沙門氏菌陽性份數(shù)為2（3.3%），氯化鎂-孔雀綠增菌-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基檢測的陽性率與傳統(tǒng)方法相當(dāng)。經(jīng)過PCR擴(kuò)增陽性樣品的fim Y基因測序鑒定，兩例陽性樣品均為沙門氏菌。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基用于飼料中沙門氏菌的檢測，具有菌落形態(tài)典型、易于分辨的特點(diǎn)，適用于飼料中沙門氏菌的檢測。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；顯色培養(yǎng)基；飼料檢測

沙門氏菌是一種常見的人畜共患食源性致病菌，在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，給人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大威脅。畜禽飼料中如果含沙門氏菌，菌量達(dá)到一定數(shù)目時，動物感染沙門氏菌可引起疾病甚至死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙畜牧業(yè)健康發(fā)展。因此，準(zhǔn)確、快速地檢測飼料中沙門氏菌，對于預(yù)防畜禽和人類沙門氏菌感染具有重要的意義。目前，飼料中沙門氏菌檢測方法是依靠普通細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)法，再將疑似菌落進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)檢測，操作繁瑣、費(fèi)事費(fèi)力，而且敏感性和特異性均較差[ 1 ]。本文對沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在飼料沙門氏菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究。

1　試驗(yàn)材料

1.1飼料樣品的采集

飼料樣品來自甘肅省內(nèi)58家養(yǎng)殖場（戶）不同種類的60份配合飼料，其中雞飼料14份，豬飼料27份，羊飼料4份，牛飼料15份。

1.2試驗(yàn)材料

緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、氯化鎂-孔雀綠增菌液（RV）、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液（SC）、酚紅煌綠瓊脂、DHL瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、三糖鐵瓊脂（TSI）、尿素瓊脂、賴氨酸脫羧試驗(yàn)培養(yǎng)基、β-半乳糖苷酶試劑，以上培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)室自行配置；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購自青島海博；快速DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

2　試驗(yàn)方法

2.1沙門氏菌的分離培養(yǎng)

沙門氏菌的傳統(tǒng)檢測方法按GB/T13091-2002進(jìn)行。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的檢測方法首先按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010進(jìn)行待檢樣品的制備，并用緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基預(yù)增菌，取預(yù)增菌培養(yǎng)物1 mL，接種于裝有氯化鎂-孔雀綠增菌液9 mL和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中，分別置于42℃培養(yǎng)和36℃培養(yǎng)24 h；分別取上述培養(yǎng)物100 μL接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)平皿上，置于37℃培養(yǎng)24 h。

2.2沙門氏菌的鑒定

挑取沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上的陽性菌落，接種于SS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16 h，取1 mL菌液提取基因組DNA，DNA提取參照試劑盒說明書進(jìn)行，進(jìn)行沙門氏菌保守基因片段的測序驗(yàn)證。

2.2.1沙門氏菌保守基因fimY的擴(kuò)增

以沙門氏菌保守基因fimY設(shè)計(jì)引物，上游引物：5' GCCGGTAAACTACA CGATGA 3'，下游引物5' GAGTTACTGAACCAACAGC T 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為526 bp[ 1 ]。最佳反應(yīng)體系：10 X PCR buffer 2.5 μL，25 mmol·L- 1，MgCl21 μL，10 mmol·L- 1dNTP 0.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Taq酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL，滅菌三蒸水19.25 μL，最后加提取的模板溶液0.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

2.2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的測序鑒定

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收預(yù)期長度的基因片段，并與pMD18-T載體連接，操作步驟按說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定為陽性的菌落，送上海生工生物工程公司測序，獲得的測序結(jié)果進(jìn)行BLAST結(jié)果比對分析。

附表　飼料沙門氏菌檢測結(jié)果

3　試驗(yàn)結(jié)果

3.1飼料中沙門氏菌的分離培養(yǎng)

飼料沙門氏菌檢測結(jié)果見附表。

按照國家標(biāo)準(zhǔn)，挑選的陽性菌落經(jīng)過生化鑒定和血清學(xué)鑒定，60個飼料樣品中陽性樣品為2份，陽性率為3.3%。沙門氏菌分離培養(yǎng)見圖1。圖1A為氯化鎂-孔雀綠增菌培養(yǎng)基-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基；圖1B為亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，其檢測的陽性樣品與傳統(tǒng)方法一致。

圖1　沙門氏菌分離培養(yǎng)

3.2沙門氏菌保守基因fimY的擴(kuò)增

根據(jù)沙門氏菌國家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，氯化鎂-孔雀綠增菌-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液沙門氏菌顯色培養(yǎng)基分離到的沙門氏菌樣品進(jìn)行fimY基因PCR擴(kuò)增，見圖2。氯化鎂-孔雀綠增菌-沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液沙門氏菌顯色培養(yǎng)基鑒定的兩例樣品中，fimY基因均擴(kuò)增成功。

圖2　fimY基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3fimY基因的測序驗(yàn)證

擴(kuò)增到的fimY基因與pMD18-T載體經(jīng)重組菌液PCR鑒定陽性的菌落測序結(jié)果分析表明，均為沙門氏菌。

4　討論

沙門氏菌傳統(tǒng)檢測方法是基于H2S和乳糖發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行的，但該類培養(yǎng)基特異性差、假陽性率高，而且費(fèi)時費(fèi)力[ 2 ]。因此，建立一種省時省力的可通過顏色顯示或發(fā)出的熒光來鑒別待檢細(xì)菌的方法，顯得尤為必要。目前，已經(jīng)有多種依據(jù)沙門氏菌生物學(xué)特征，如α-半乳糖苷酶活性、C8-酯酶活性等研制的顯色培養(yǎng)[ 3 ]。也有大量關(guān)于顯色培養(yǎng)基的靈敏度和特異性研究的報(bào)道[ 4-5 ]。

本試驗(yàn)利用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基對60例飼料中沙門氏菌進(jìn)行檢驗(yàn)，飼料樣品首先利用增菌培養(yǎng)液預(yù)增菌，分別再用氯化鎂-孔雀綠增菌液和亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)液選擇性增菌后，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，生長的菌落直徑較大、菌落數(shù)量比普通培養(yǎng)基多，而且可以通過菌落的顏色進(jìn)行辨識，能夠有效降低后續(xù)生化鑒定、血清學(xué)鑒定的工作量，具有簡便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

目前，以細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)鑒定為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)微生物分析檢測技術(shù)仍然是細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在沙門氏菌的檢出率上與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，但其能夠有效抑制其他雜菌的生長，通過菌落顏色可以判斷陽性菌落，減少了后續(xù)驗(yàn)證的工作量。由于本試驗(yàn)樣品種類和數(shù)量有限，還需要進(jìn)行大量樣本的驗(yàn)證，進(jìn)一步評價沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在飼料檢測中的推廣應(yīng)用價值。隨著微生物顯色培養(yǎng)基的靈敏度和特異性的進(jìn)一步提高，由于其特有的優(yōu)勢可能會逐漸被國際國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)所采用[ 6- 7 ]。

[參考文獻(xiàn)]

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Evaluation of Chromogenic Media for SalmonellaDetection in Animal Feeding Stuffs

YANG Hongyan1, CAI RANG Zhuoma1, TANG Yu1, FENG Haixia2, ZHANG Ying2, CAI Chuanyong3, CHANG Yunchao2, CHE Tuanjie3*

（1. Control Institute of Feed and Pharmaceuticals, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Bio-array of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Function Genome and Molecular Detection of Gansu Province, Lanzhou 730000, China）

Abstract:This trial evaluated chromogenic Salmonella agar in comparison with a conventional culture method in detecting Salmonella in feed in the presence of Salmonella spp. The culture method for the detection of Salmonel?la rely on pre-enrichment in Rappaport-Vassiliadis soy broth(RVS) or Selenite cystine medium(SC). After enrich?ment, we compared chromogenic agar with a classic conventional culture method for animal feeding stuffs. Salmonel?la were isolated from 2 of the 60 samples(3.3%) with conventional culture methods and chromogenic agar. The posi?tive samples were confirmed by PCR method amplifying and sequencing the fim Y gene of Salmonella spp. The results indicated that the enrichment broths combingchromogenic Salmonella agar had agreat effect on rapid visual?ization of Salmonella spp. colonies for surveillance of Salmonella infections in animal feedingstuffs.

Key words:Salmonella; chromogenic medium; feedingdetection

作者簡介：楊紅巖（1966-），女，藏族，甘肅迭部人，高級獸醫(yī)師，主要從事動物產(chǎn)品質(zhì)量安全及飼料安全檢測。

收稿日期：2015-12-11

中圖分類號：S852.6；S816

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-0084（2016）02-0043-03