馬 英，王曉臨

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

沙棘三寶膠囊干預(yù)大鼠肝纖維化的作用※

馬 英1，2，王曉臨2#

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 研究沙棘三寶膠囊對(duì)大鼠肝纖維化的影響。方法 將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(16只，生理鹽水1.0 mL/kg)、陰性對(duì)照組(16只，橄欖油1.0 mL/kg)和肝纖維化模型組(40只，CCL4+橄欖油1.0 mL/kg)。將成功造模大鼠分為模型組(8只，生理鹽水1.0 mL/kg)、沙棘三寶膠囊組(每組8只，沙棘三寶膠囊低、中、高劑量組，劑量分別為0.13、0.26、0.65 g/kg)。每天灌胃給藥1次，連續(xù)60天。使用生化分析儀檢測血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST，使用放射免疫法檢測透明質(zhì)酸(HA)、IV型膠原(CIV)的變化并做組織病理學(xué)觀察。結(jié)果 中、高劑量的沙棘三寶膠囊能夠明顯降低肝纖維化大鼠HA、ALT、AST含量(P<0.05)并能抑制大鼠肝組織纖維化增生。其中，中劑量藥物干預(yù)肝纖維化的作用更優(yōu)。結(jié)論 沙棘三寶膠囊對(duì)大鼠肝纖維化有一定的干預(yù)作用。

沙棘三寶膠囊 肝纖維化 作用

實(shí)驗(yàn)用沙棘三寶膠囊由沙棘、山楂、枸杞等組成，甘草浸膏少許，其中主要成分為沙棘，生產(chǎn)批號(hào)為青衛(wèi)食證字(2009)第630000-400004號(hào)。本研究旨在探討沙棘三寶膠囊對(duì)肝纖維化的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

SPF級(jí)SD大鼠72 只，體重200±20 g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYKX(甘)2011-0001)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)5天。隨機(jī)選取16只作為空白對(duì)照組，16只作為陰性對(duì)照組，雌雄各半；其余40只大鼠用于構(gòu)建肝纖維化動(dòng)物模型。大鼠飼養(yǎng)溫度：25 ℃左右，濕度：50%，光照：7 am～7 pm開燈。期間大鼠自由獲取飲食及飲水。

1.2 大鼠肝纖維化模型構(gòu)建

將CCL4和橄欖油以1：1(V/V)的比例混勻后灌胃給藥(1.0 mL/kg)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組分別以相同劑量的生理鹽水和純橄欖油灌胃，每天一次，持續(xù)灌胃60天。從空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和模型建立組中各取8只，禁食不禁水過夜，第二天空腹稱重，麻醉后腹腔動(dòng)脈取血，分離血清，取肝臟、脾臟稱重，用10%福爾馬林溶液固定肝組織；檢測血清肝纖維化指標(biāo)，觀察肝組織病理切片，判斷模型是否成功建立。

1.3 實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用沙棘三寶膠囊的使用劑量為0.13、0.26、0.65 g/kg(其中將成人劑量通過人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等效公式換算后得出實(shí)驗(yàn)用藥的中劑量)。將實(shí)驗(yàn)開始時(shí)16只空白對(duì)照組動(dòng)物所剩8只分至空白組(8只，生理鹽水1.0 mL/kg)，16只陰性對(duì)照組動(dòng)物所剩8只分至陰性組(8只，橄欖油1.0 mL/kg)，將成功造模大鼠分為模型組(8只，生理鹽水1.0 mL/kg)、沙棘三寶膠囊組(每組8只，沙棘三寶膠囊低、中、高劑量組，劑量分別為0.13、0.26、0.65 g/kg)。6組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天灌胃一次，60天后，各組禁食不禁水過夜，第二天空腹稱重，麻醉后腹腔動(dòng)脈取血，分離血清；取肝臟稱重，用10%福爾馬林溶液固定肝組織。

1.4 血清檢測及組織病理學(xué)觀察

大鼠腹腔動(dòng)脈取血后離心(4 ℃，3000 r/min)取血清，使用生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；放射免疫法檢測透明質(zhì)酸(HA)、IV型膠原(CIV)。觀察各組病理組織切片圖，褐色部分均為肝組織纖維化部分，褐色組織越多，肝纖維化程度越重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS19.0軟件包，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較使用方差分析，兩兩比較使用LSD法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器系數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)公式：肝臟系數(shù)=肝臟重量(g)/動(dòng)物采血前重量(g)×100%；脾臟系數(shù)=脾臟重量(g)/動(dòng)物采血前重量(g)×100%；計(jì)算模型建立終期時(shí)空白組、陰性對(duì)照組和模型建立組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟器系數(shù)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝臟系數(shù)明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，且有統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05)(見表1)。

表1 不同處理方法對(duì)肝纖維化模型大鼠肝臟系數(shù)及脾臟系數(shù)的影響結(jié)果(n=8)

*：與空白組對(duì)比，P<0.05；#：與陰性組對(duì)比，P<0.05.

2.2 模型建立后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生化指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將CCL4和橄欖油以1：1(V/V)的比例混勻后灌胃給藥(1.0 mL/kg)60天后，大鼠生化指標(biāo)ALT、AST、HA明顯高于空白組、陰性對(duì)照組，而CIV未發(fā)生明顯變化(見表2)。說明該方法成功構(gòu)建大鼠肝纖維化模型。

表2 不同處理方法對(duì)肝纖維化模型大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果的影響結(jié)果(n=8)

*：與空白組對(duì)比P<0.05；#：與陰性組對(duì)比P<0.05.

2.3 給藥60天后大鼠血清生化指標(biāo)檢測

模型組大鼠ALT、AST、HA均高于空白組(P<0.05)，沙棘三寶膠囊低劑量組與模型組對(duì)比，HA降低較模型組明顯(P<0.05)；ALT、AST均未見降低趨勢；給藥中劑量組與模型組相比，ALT、AST、HA均呈明顯降低趨勢(P<0.05)。給藥高劑量組與模型組相比，AST、HA均呈較明顯降低趨勢(P<0.05)，ALT雖數(shù)值上有降低，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；給藥中劑量組與高劑量組相比，中劑量組藥物下調(diào)肝纖維生化指標(biāo)AST、ALT的作用更優(yōu)于高劑量組(P<0.05)；各組之間CIV未發(fā)生明顯變化。

表3 不同處理方法對(duì)肝纖維化大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果的影響結(jié)果(n=8)

*：與空白組對(duì)比，P<0.05；#：與模型組對(duì)比，P<0.05；△：與中劑量組比，P<0.05.

2.4 沙棘三寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中I、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

圖1為大鼠肝臟組織中I型膠原的表達(dá)情況。從圖中可以看出，模型組與空白組對(duì)照，褐色的纖維化組織明顯增多。沙棘三寶膠囊中劑量組與模型組相比，肝纖維化程度降低，中劑量組的效果更好。

圖1 各組大鼠肝臟組織中I型膠原蛋白檢測結(jié)果圖(1×400)

圖2為大鼠肝臟組織中Ⅲ型膠原的表達(dá)情況。從圖中可以看出，模型組與空白組對(duì)照，褐色的纖維化組織明顯增多。沙棘三寶膠囊中劑量組與模型組相比，肝纖維化程度降低。其中沙棘三寶膠囊的低、中、高三個(gè)劑量中，中劑量組效果更好。

圖2 各組大鼠肝臟組織中Ⅲ型膠原蛋白檢測結(jié)果圖(1×400)

3 討論

肝纖維化是肝臟疾病的重要轉(zhuǎn)歸，它的特點(diǎn)是細(xì)胞外的間質(zhì)過分沉積，是肝臟疾病向肝硬化進(jìn)展的早期階段，但其可以被逆轉(zhuǎn)[1]。目前臨床上診斷肝臟疾病主要靠血清學(xué)檢測。HA為蛋白多糖的一種，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，能夠作為肝纖維化和肝硬化的檢測指標(biāo)，具有較好的敏感性和特異性，能夠反映肝細(xì)胞的受損情況。在肝纖維化的過程中，檢測血清生化指標(biāo)如AST、ALT等都能不同程度地反映肝臟病變程度[2]。

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明沙棘籽油在保護(hù)肝細(xì)胞及有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等方面有重要作用，它能夠抑制四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)的肝纖維化發(fā)展的進(jìn)程[3]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型構(gòu)建期間，模型組的動(dòng)物血清HA、AST、ALT與空白組對(duì)比顯著升高，該現(xiàn)象與機(jī)體肝纖維化過程中各指標(biāo)的改變趨勢一致。并且模型動(dòng)物的肝臟系數(shù)升高，體重降低，也證明動(dòng)物模型構(gòu)建成功。給藥60天后，空白組血清HA、AST、ALT卻比模型組低，說明模型組動(dòng)物在正常的生理情況下，具有自行恢復(fù)的特點(diǎn)，但纖維化水平仍大于空白組。給藥60天后，沙棘三寶膠囊中劑量組、高劑量組與模型組對(duì)比，ALT、AST、HA均低于模型組。我們發(fā)現(xiàn)給藥中劑量組沙棘三寶膠囊下調(diào)ALT、AST的作用優(yōu)于高劑量組。模型組的檢測值明顯高于空白組和陰性對(duì)照組，說明模型構(gòu)建成功。

本研究結(jié)果提示，沙棘三寶膠囊對(duì)肝臟保護(hù)基于下調(diào)ALT、AST的機(jī)制。模型組值降低，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身恢復(fù)的結(jié)果；給藥組值降低，是藥物治療肝纖維(主要)和動(dòng)物自身恢復(fù)(附加)的雙重結(jié)果。沙棘三寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中I、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響顯示，中、高劑量組與模型組相比，肝纖維化程度明顯減輕，其中中劑量組的效果更為明顯。實(shí)驗(yàn)過程中CIV在各組間無明顯差異。

綜上所述，用CCL4和橄欖油可以成功構(gòu)建肝纖維化模型。中、高劑量的沙棘三寶膠囊能夠明顯降低肝纖維化大鼠HA、ALT、AST含量(P<0.05)，并能抑制大鼠肝組織纖維化增生。其中，中劑量藥物干預(yù)肝纖維化的作用更優(yōu)。

[1]Visse R，Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases：structure，function，and biochemistry[J].Circ Res.2003，92(8)：827-39.

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The effect of Sanbaofructushippophaecapsules on hepatic fibrosis in rats

MA Ying1，2，WANG Xiao-lin2

(1.QingHai University Medical College；2.Qinghai University Affiliated Hospital)

Objective To investigate the effect of Sanbaofructushippophaecapsules on hepatic fibrosis in rats.Methods SD rats(200±20 g) were randomly divided into 3 different group：blank group(n=16，normal saline1.0 mL/kg)，negative control group(n=16，olive oil 1.0 mL/kg)and model group(n=40，CCL4+olive oil1.0 mL/kg).After establishing the model of hepatic fibrosis，the rats were randomly divided into model group(n=8，normal saline1.0 mL/kg)，Sanbaofructushippophaegroup(low，middle and high dose groups，the dosage were 0.13，0.26，0.65 g/kg，respectively.).These regents were intragastrically administrated to the rats for 60 consecutive days.The level of ALT，AST in blood were detected by biochemistry method.The level of HA，CIV were detected by radioimmunoassay.The histopathological change of liver was tested by immunohistochemical method.Results The level of HA，ALT，AST was decreased in middle and high dosage of Sanbaofructushippophae(P<0.05).Also the degree of hepatic fibrosis was reduced.We found that the middle dosage of Sanbao showed better effect in rats.Conclusion Sanbaofructushippophaeshows a protective effect on hepatic fibrosis in rats.

SanbaofructushippophaeHepatic fibrosis Mechanism

R575.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.004

2016-06-09

※：青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013-Z-729) 馬英(1990～)，男，回族，青海籍，2014級(jí)科學(xué)班研究生

#：通信作者，博士，E-mail：wangxl63@126.com