王 婷，趙 培，李 楠，王雪青（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

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低溫誘導(dǎo)球等鞭金藻3011脂肪酸去飽和酶基因片段的篩選及mRNA表達(dá)分析

王 婷，趙 培，李 楠，王雪青*
（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

摘 要：本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)特異引物序列，對(duì)經(jīng)低溫誘導(dǎo)處理的球等鞭金藻3011的脂肪酸去飽和酶基因片段進(jìn)行篩選，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測酶的表達(dá)量，探索低溫對(duì)該多不飽和脂肪酸脫飽和酶基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：用prime5設(shè)計(jì)包括內(nèi)參基因在內(nèi)的14 條引物，其中7 條引物具有特異性擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效果對(duì)其擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12 mRNA相對(duì)最大表達(dá)量分別為7.71、11.33、42.58、22.02、73.91和16.01。隨溫度的降低均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。根據(jù)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析，6 個(gè)基因在其mRNA相對(duì)表達(dá)量最大的誘導(dǎo)時(shí)間時(shí)，18 ℃的mRNA相對(duì)表達(dá)量與其在12、15、21 ℃ 3 個(gè)溫度條件下的相對(duì)表達(dá)量相比具有極顯著差異（P＜0.01）。18 ℃條件下誘導(dǎo)24 h可以有效增加Des9基因在球等鞭金藻3011中的表達(dá)。此研究結(jié)果為人為調(diào)控微藻的多不飽和脂肪酸含量提供了一條可行的方法。

關(guān)鍵詞：低溫；脂肪酸去飽和酶；球等鞭金藻3011；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；基因表達(dá)

引文格式：

王婷,趙培,李楠,等.低溫誘導(dǎo)球等鞭金藻3011脂肪酸去飽和酶基因片段的篩選及mRNA表達(dá)分析[J].食品科學(xué),2016,37(5):132-137.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605024.http://www.spkx.net.cn

WANG Ting,ZHAO Pei,LI Nan,et al.mRNA Expression analysis and screening of fatty acid desaturase gene in Isochrysis galbana 3011 under low-temperature induction[J].Food Science,2016,37(5):132-137.(in Chinese with English abstract)

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長度為18～22 個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸[1]，研究顯示其具有許多獨(dú)特的生物活性[2-6]，由于人體自身合成的PUFAs并不能滿足自身需求，因此需從膳食中補(bǔ)充，因此研究和開發(fā)富含PUFAs的食品以及保健品具有重要意義。陸生的動(dòng)、植物僅含有微量的二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十二碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA），而海洋來源的動(dòng)、植物中富含PUFAs，如深海魚油，但產(chǎn)品由于存在一系列的問題[7-8]，從而限制了其大規(guī)模應(yīng)用。藻類是水體中處于食物鏈最低級(jí)的微小生物，藻體中含有優(yōu)質(zhì)的PUFAs，并且微藻易人工培養(yǎng)調(diào)控，因此研究和探索適合藻種合成PUFAs的培養(yǎng)條件，成為其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

溫度是影響微藻生長的十分重要環(huán)境條件之一，也是很容易調(diào)控的外界環(huán)境因素。已經(jīng)有研究報(bào)道，溫度等環(huán)境因子可以影響柵藻、甲藻以及小球藻的PUFAs的組成及含量[9-13]，而關(guān)于其影響球等鞭金藻（Isochrysis galbana）3011的PUFAs的組成及含量相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

球等鞭金藻3011屬于金藻門、普林藻綱、等鞭藻目，等鞭藻科的微藻，由于無細(xì)胞壁，易消化，且富含DHA、EPA以及多糖等活性物質(zhì)，是貝類等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的開口餌料。本研究以球等鞭金藻3011為材料，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fl uorescence quantitative polymerase chain reaction，real time-qPCR）技術(shù)研究不同溫度處理對(duì)該藻去飽和酶基因mRNA表達(dá)影響，及溫度調(diào)節(jié)去飽和酶表達(dá)的模式，為實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控特定多不飽和脂肪酸的合成和積累提供理論指導(dǎo)，并為利用微藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)DHA、EPA提供一種可行的方法。

1　材料與方法

1.1菌株與試劑

球等鞭金藻3011 中國海洋大學(xué)贈(zèng)予。

焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）、Trizol試劑 北京康為世紀(jì)有限公司；TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本Toyobo公司；SYBR Select Master Mix染料試劑盒 美國AB公司。

1.2儀器與設(shè)備

TGL-16G臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；real time-qPCR擴(kuò)增儀、Gel DocTM凝膠電泳成像分析系統(tǒng)、ChemiDoc凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；UV-2550微量紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國AB公司。

1.3方法

1.3.1RNA的提取與鑒定

利用Trizol試劑說明書的步驟取RNA，紫外-可見分光光度計(jì)測定RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

1.3.2cDNA的合成及引物設(shè)計(jì)

使用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用primer5軟件設(shè)計(jì)脂肪酸去飽和的參數(shù)和酶基因的序列，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1　引物名稱和序列Table 1 Names and sequences of primers

1.3.3PCR及real time-qPCR擴(kuò)增與檢測

1.3.3.1PCR擴(kuò)增

利用PCR檢測引物特異性，體系如下：正、反引物濃度：200 nmol/L；cDNA模板：200 ng；10×buffer：5 ?L；dNTP：200 mmol/L；Taq酶：2.5 U；ddH2O：39.5 ?L。按照PCR擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，1 個(gè)循環(huán)；4 ℃保溫，進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.3.2real time-qPCR檢測

接種后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，分別在21、18、15、12 ℃條件下誘導(dǎo)24、48、72、96 h（每組設(shè)有3 個(gè)平行樣品），提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR?Select Master Mix染料試劑盒說明書進(jìn)行real time-qPCR，體系如下：SYBR?Select Master Mix（2×）10 ?L、正、反引物200 nmol/L、cDNA模板200 ng、水6.4 ?L。反應(yīng)程序：階段1，95 ℃ 10 min；階段2，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線階段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.4基因相對(duì)表達(dá)量的測定

利用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子顯著性比較。

式中：2表示循環(huán)間擴(kuò)增產(chǎn)物量的倍數(shù)變化；ΔΔCt表示處理樣本和對(duì)照樣本之間校正過的循環(huán)數(shù)變化。

2　結(jié)果與分析

2.1內(nèi)參基因與序列的選擇

可以作為real time-qPCR的內(nèi)參有很多，例如：3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehydes phosphate dehydrogenase，GAPDH）、β-肌動(dòng)蛋白以及18S rRNA 等[14-15]，18S rRNA含量穩(wěn)定且序列保守是作為藻類的內(nèi)參基因首選，故本實(shí)驗(yàn)將以18S rRNA作為real time-qPCR的內(nèi)參。根據(jù)多不飽和脂肪酸的合成途徑中關(guān)鍵多不飽合脂肪酸去飽和酶的作用，挑選出Des4、Des5、Des6、Des8、Des9、Des9E、Des12、Desω-3 8 個(gè)關(guān)鍵酶，根據(jù)全基因序列以及引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物基因序列如表1所示。

2.2多不飽和脂肪酸去飽和酶（fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）基因片段的篩選

多不飽和脂肪酸去飽和酶基因FAD18S、FAD4、FAD5’、FAD6、FAD8’、FAD9’和FAD12’擴(kuò)增結(jié)果的熔解曲線具有相同性，都僅有一個(gè)銳利的峰，Tm值不是二聚體所在溫度范圍內(nèi)，說明引物具有特異性，所以FAD18S可作為內(nèi)參，其余的可作為實(shí)時(shí)熒光定量的引物；FAD5、FADω-3雖然有一個(gè)峰值，但峰并不銳利，表明這兩條引物不具有特異性；FAD8、FAD6’引物不穩(wěn)定，雖然有銳利的峰出現(xiàn)，可能存在非特異性的結(jié)合位點(diǎn)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成實(shí)驗(yàn)的誤差；FAD9引物具有非特異性干擾，雖然存在一個(gè)銳利的峰，可依然有平緩的峰存在，非特異性的存在會(huì)影響Ct值，對(duì)結(jié)果造成誤差；FAD9E出現(xiàn)的峰熔解溫度Tm＝65.74 ℃，Tm值在60～75 ℃，判定FAD9E為二聚體，所以以上引物則不能作為實(shí)時(shí)熒光定量引物。

利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)FAD18S、FAD4、FAD5’、FAD6、FAD6’、FAD8’、FAD9’、FAD12’、FAD8、 FAD9、FAD5、FAD9E、FADω-3的特異性進(jìn)行檢測，如圖1所示。

圖1　real time-qPCR特異性產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of specific amplification products by real time-qPCR

由圖1可知，F(xiàn)AD18S、FAD4、FAD5’、FAD6、FAD8’、FAD9’和FAD12’條帶唯一，并沒有雜帶，具有特異性，與Marker片段大小相比，沒有小于100 bp的條帶，說明并沒有二聚體的存在，且條帶片段大小與引物設(shè)計(jì)相吻合，具有特異性。FAD5、FAD8和FADω-3引物條帶模糊，且序列長度在100 bp左右，屬于二聚體。FAD9E沒有明顯條帶，沒有結(jié)合位點(diǎn)。因此確定FAD18S、FAD4、FAD5’、FAD6、FAD8’、FAD9’和FAD12’的序列用于Des18S、Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12基因的合成。

2.3多不飽和脂肪酸去飽和酶基因片段序列比對(duì)

根據(jù)測序結(jié)果和不同藻種中已知的Des6全基因序列進(jìn)行比對(duì)，所測序列與Huerlimann等[14]的實(shí)驗(yàn)所得球等鞭金藻去飽和酶基因序列相似度為97%（表2），與其他藻種基因序列對(duì)比并無相似性，確定引物設(shè)計(jì)的脂肪酸去飽和酶基因?yàn)榍虻缺藿鹪迦蛐蛄兄卸嗖伙柡椭舅崛ワ柡兔富蚱?。?shí)驗(yàn)序列和球等鞭金藻去飽和酶基因序列BLAST分析如表2所示，所測序列的第7～342個(gè)堿基與球等鞭金藻3011 Des6基因全序列的第77～337個(gè)堿基片段中僅有第10個(gè)堿基缺少，第256、260、261、297、299、300、311、358個(gè)堿基與已知序列堿基不相符，共占總基因片段的2.67%。

表2　球等鞭金藻3011基因片段與DDeess66全基因序列BLASTT對(duì)比分析Table 2 BLAST analysis of Isochrysis galbana 3011 FAD6 gene fragment and Des6 full sequence

2.4 溫度調(diào)控對(duì)基因表達(dá)量的分析

樣品在12、15、18、21 ℃條件下分別誘導(dǎo)24、48、72、96 h，將0 h的基因表達(dá)量設(shè)為1，作為對(duì)照組，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性比較。

圖22　DDeess44、DDeess55、DDeess66、DDeess88、DDeess99、DDeess1122基因mRNA相對(duì)表達(dá)量在不同溫度下隨時(shí)間變化對(duì)比結(jié)果Fig.2 Relative mRNA expression amounts of Des 4,Des 5,Des 6,Des 8,Des 9 and Des 12 at different temperatures as a function of induction time

由圖2可知，Des4、Des5、Des6、Des8、Des9、Des12基因mRNA相對(duì)最大表達(dá)量分別為7.17、11.33、42.58、22.02、73.91和16.01。且對(duì)低溫誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感的為Des9基因，Des4基因?qū)Φ蜏卣T導(dǎo)最不敏感。當(dāng)誘導(dǎo)溫度作為不變因素時(shí)發(fā)現(xiàn)：Des4、Des8和Des12基因的mRNA相對(duì)最大表達(dá)量出現(xiàn)在48 h處，Des5、Des6、Des9基因則是在24 h時(shí)出現(xiàn)了最大的mRNA相對(duì)表達(dá)量，6 個(gè)基因在24、48 h具有顯著性差異，72、96 h時(shí)，顯著性差異不大。6 個(gè)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在相同誘導(dǎo)時(shí)間下，隨著溫度的降低呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，18 ℃時(shí)6 個(gè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量最大；21、18、15 ℃條件下誘導(dǎo)72 h內(nèi)Des9基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量最大，12 ℃時(shí)誘導(dǎo)96 h內(nèi)Des6基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量最大，6 個(gè)基因在其mRNA相對(duì)表達(dá)量最大的誘導(dǎo)時(shí)間時(shí)，18 ℃條件下的mRNA相對(duì)表達(dá)量與其他3 個(gè)溫度相比具有極顯著性差異（P＜0.01）。

相同溫度下，當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)至96 h（除了Des5基因在18 ℃和Des6基因在21、18、15 ℃）時(shí)，mRNA相對(duì)表達(dá)量幾乎都小于對(duì)照組的值，表明機(jī)體通過改變酶的表達(dá)量來抵御冷脅迫屬于短暫效應(yīng)，并不能長時(shí)間存在。在相同時(shí)間下，18 ℃條件下mRNA相對(duì)表達(dá)量最大說明藻細(xì)胞對(duì)冷脅迫的抵抗能力有一定的范圍，當(dāng)超過藻細(xì)胞的承受范圍則會(huì)加速藻細(xì)胞的凋亡。

3 討論與結(jié)論

低溫環(huán)境成為改變植物/微藻多不飽和脂肪酸組成和含量的重要外界因子[16-17]。適當(dāng)?shù)牡蜏乜墒股锬ぶ牧鲃?dòng)性下降，機(jī)體通過主動(dòng)的增加膜脂不飽和度以維持膜的正常流動(dòng)性。在脂肪酸的合成過程中，去飽和酶和延長酶活力消漲變化，能夠改變膜脂雙層中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例或者改變脂肪酸酰基鏈的長度、支鏈脂肪酸的比例以及環(huán)狀脂肪酸的比例。

由本實(shí)驗(yàn)看出，培養(yǎng)環(huán)境低溫誘導(dǎo)對(duì)多不飽和脂肪酸去飽和酶基因相對(duì)表達(dá)量不僅與溫度有關(guān)，也與作用時(shí)間相關(guān)。當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)過長，會(huì)導(dǎo)致有毒產(chǎn)物的出現(xiàn)，影響藻體的正常代謝活動(dòng)，最終導(dǎo)致藻體的凋亡。同樣，在適當(dāng)?shù)牡蜏卣T導(dǎo)會(huì)使酶的基因表達(dá)量增加，過低的溫度不僅不會(huì)提高酶的基因表達(dá)量，甚至?xí)?dǎo)致酶的基因表達(dá)量下降。藍(lán)藻中Des6、Des9、Des12和Desω-3基因已被證明具有冷調(diào)節(jié)性，低溫下去飽和酶轉(zhuǎn)錄與翻譯水平比最適溫度培養(yǎng)的水平均有顯著提高[18-19]。適當(dāng)?shù)牡蜏貙?dǎo)致去飽和酶基因表達(dá)量的增加，可以使細(xì)胞膜的成分改變，細(xì)胞膜的流動(dòng)性維持在原來的水平。在小球藻中，當(dāng)溫度降低后轉(zhuǎn)錄水平逐漸提高，Des12基因和Des15基因的轉(zhuǎn)錄水平分別在誘導(dǎo)后的24 h和3 h可達(dá)到初始轉(zhuǎn)錄水平的3.2 倍和5.4 倍[20]，和本實(shí)驗(yàn)得出不同脂肪酸去飽和酶基因最大表達(dá)量不一定在相同誘導(dǎo)時(shí)間的結(jié)論相同。Miyasaka[21]和An Meiling[22]等分別研究不同溫度對(duì)衣藻和南極衣藻的基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：前者的Des12基因在溫度從25 ℃降到4 ℃時(shí)，其轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到初始轉(zhuǎn)錄水平的2.3 倍，而溫度從25 ℃升到38 ℃后，轉(zhuǎn)錄水平僅為初始轉(zhuǎn)錄水平的87%，后者的Des9、Des12和Desω-3基因在相對(duì)低溫（0 ℃）下的基因表達(dá)量高于正常溫度（8 ℃）下的基因表達(dá)量，且Des9和Des12基因在48 h出現(xiàn)最大表達(dá)量，Desω-3基因表達(dá)量最大值出現(xiàn)在24 h，而本實(shí)驗(yàn)Des9基因表達(dá)量最大值出現(xiàn)在24 h，這可能是種屬間存在差異性。

Ca2＋可以通過傳感器感應(yīng)溫度的變化可將信號(hào)傳遞給調(diào)節(jié)分子，激活促分裂素原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）、轉(zhuǎn)錄因子（C-repeat binding factors，CBF）等信號(hào)通路，最后與去飽和酶基因的調(diào)控區(qū)域相互作用，激活轉(zhuǎn)錄，增加去飽和酶含量，導(dǎo)致不飽和脂肪酸的含量增加，從而恢復(fù)膜的流動(dòng)性[23-24]。但是過低的溫度刺激或者適當(dāng)?shù)牡蜏卣T導(dǎo)時(shí)間過長都會(huì)引起一些副產(chǎn)物的形成：丙二醛等，影響一些信號(hào)通路（MAPK、CBF等）的形成，中斷信號(hào)的延伸。宮相忠等[25]的實(shí)驗(yàn)表明：在24 h時(shí)丙二醛的含量并無太大變化，48 h的含量是24 h含量的1.4 倍左右，之后呈現(xiàn)相對(duì)平緩的趨勢。本實(shí)驗(yàn)得出：在不同溫度和不同時(shí)間時(shí)去飽和酶基因表達(dá)量并不同，表明低溫可以調(diào)控去飽和酶的基因的表達(dá)量。

本研究利用prime5設(shè)計(jì)出1 條內(nèi)參和6 條符合擴(kuò)增條件的特異性引物序列。以24 ℃作為對(duì)照，降低培養(yǎng)溫度來研究溫度對(duì)藻體脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)量的影響：18 ℃條件下脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)量最高，過低的溫度會(huì)使脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)量降低；Des5、Des6和Des9基因在24 h的mRNA表達(dá)量最大，Des4、Des8和Des12基因在48 h的mRNA表達(dá)量最大，誘導(dǎo)時(shí)間過長同樣會(huì)使脂肪酸去飽和酶基因的表達(dá)量下降；Des9基因的mRNA表達(dá)量為73.91，對(duì)低溫敏感度最高，Des4基因的mRNA表達(dá)量為7.17，對(duì)低溫敏感度最小。根據(jù)測序和real time-qPCR顯示結(jié)果表明調(diào)控溫度能夠影響球等鞭金藻3011的脂肪酸去飽和基因的表達(dá)量。

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mRNA Expression Analysis and Screening of Fatty Acid Desaturase Gene in Isochrysis galbana 3011 under Low-Temperature Induction

WANG Ting,ZHAO Pei,LI Nan,WANG Xueqing*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China)

Abstract:In the present study,the specific primers were designed for the screening of the fatty acid desaturase gene in Isochrysis galbana 3011 under low-temperature induction and for the determination of fatty acid desaturase by real time-qPCR.Results showed that of 14 primers designed using prime5,7 provided specific amplification.Based on amplification efficiency,the largest relative expression amounts of Des4,Des5,Des6,Des8,Des9 and Des12 were 7.71,11.33,42.58,22.02,73.91 and 16.01,respectively,all of which dropped after an initial rise with decreasing temperature.Statistical analysis performed using SPSS19.0 software indicated that there was highly significant difference between the relative expression amounts of 6 genes at 18 ℃ and those obtained at three other temperatures 12,15,21 ℃(P 0.01).The induction at 18 ℃ for 24 h could effectively increase the expression of Des9 in Isochrysis galbana 3011.This study has demonstrated a feasible method to manipulate the content of polyunsaturated fatty acids in microalgae.

Key words:low temperature; fatty acids desaturase; Isochrysis galbana 3011; real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(real time-qPCR); gene expression

中圖分類號(hào)：TS254.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）05-0132-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605024 10.7506/spkx1002-6630-201605024.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：王雪青（1964—），女，教授，博士，主要從事天然活性物質(zhì)的研究與開發(fā)。E-mail：wxqing@tjcu.edu.cn

作者簡介：王婷（1989—），女，碩士研究生，主要從事微藻生理生化研究。E-mail：xuantingqian@aliyun.com

基金項(xiàng)目：天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20120603）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270050；31071522；31171674）

收稿日期：2015-01-25