傅 婷，萬(wàn) 驥，王 丹，唐云明（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚(yú)類(lèi)資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

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牛腎溶菌酶的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)

傅 婷，萬(wàn) 驥，王 丹，唐云明*
（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚(yú)類(lèi)資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

摘 要：將新鮮牛腎勻漿后，經(jīng)由緩沖液提取，正丁醇除脂，硫酸銨分級(jí)沉淀，CM-Sepharose陽(yáng)離子交換層析，Superdex-200凝膠過(guò)濾層析后得到電泳純的牛腎溶菌酶。結(jié)果表明：該酶比活力為15 145.63 U/mg，回收率為29.13%，純化倍數(shù)為231.05；分子質(zhì)量約12.66 kD，為單亞基酶。最適反應(yīng)溫度為65 ℃，在65 ℃以下較穩(wěn)定；最適pH 9.0，pH值在3.0～9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；測(cè)得最適條件下牛腎溶菌酶對(duì)溶壁微球菌的Km值為0.399 μg/mL；甲醇、乙醇、異丙醇和硫氰化鉀（KSCN）對(duì)該酶有激活作用；十二烷基硫酸鈉、Pb2＋、Ag＋對(duì)該酶有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞：牛腎；溶菌酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

引文格式：

傅婷,萬(wàn)驥,王丹,等.牛腎溶菌酶的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué),2016,37(5):126-131.DOI:10.7506/

spkx1002-6630-201605023.http://www.spkx.net.cn

FU Ting,WAN Ji,WANG Dan,et al.Isolation,purifi cation and partial characterization of lysozyme from bovine kidney[J].

Food Science,2016,37(5):126-131.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605023.

http://www.spkx.net.cn

溶菌酶，又叫細(xì)胞壁水解酶，是專(zhuān)門(mén)作用于細(xì)菌細(xì)胞壁使得細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物逸出從而使細(xì)菌溶解的一種酶，在高等動(dòng)植物組織及其分泌物、原生動(dòng)物、昆蟲(chóng)和各種微生物中廣泛存在[1]。溶菌酶應(yīng)用廣泛，它作為一種蛋白質(zhì)，因其無(wú)毒副作用可用作食品防腐劑；因其抗病毒、抗腫瘤等藥理特性，可用于出血和鼻炎等癥狀的治療；此外，它作為重要的工具酶應(yīng)用于基因工程和細(xì)胞工程領(lǐng)域，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的必需酶[2]。在倡導(dǎo)“綠色食品”、“綠色生活”的當(dāng)今社會(huì)，溶菌酶以其天然安全的特性引起人們的廣泛關(guān)注[3]，雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)外科研工作者也對(duì)多種來(lái)源的溶菌酶做了大量研究工作[4-7]，但是我國(guó)溶菌酶的研究尚處于起步階段，來(lái)源仍以蛋清為主，很多問(wèn)題例如開(kāi)發(fā)新的溶菌酶資源、獲得酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的溶菌酶、降低生產(chǎn)成本等還需進(jìn)行深入研究[8]。牛腎作為一種牛副產(chǎn)品，價(jià)廉易得，牛腎溶菌酶含量較高、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)從牛腎中分離純化溶菌酶，并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，為牛腎資源的開(kāi)發(fā)利用、獲得一條全新的溶菌酶取材途徑及牛腎溶菌酶的深入研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮牛腎，購(gòu)于重慶市北碚區(qū)天生菜市場(chǎng)。

Superdex-200凝膠層析分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE Healthcare公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Bio-Rad公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)樣品 北京索萊寶科技有限公司；甲叉-雙丙烯酰胺、丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；溶壁微球菌凍干粉 美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1牛腎溶菌酶粗酶液的制備

新鮮牛腎經(jīng)去離子水洗凈、剪除結(jié)締組織和脂肪、剪碎后稱(chēng)取50 g，按1∶3（m/V）的比例加入50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 5.8），勻漿后放置在4 ℃冰箱中靜置提取12 h，12 000 r/min離心30 min，收集上清，按10%的體積比加入預(yù)冷的正丁醇，放入4 ℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min離心30 min，棄去正丁醇層，收集上清即得粗酶液。

1.2.2硫酸銨分級(jí)沉淀

向粗酶液中加入硫酸銨粉末至30%的飽和度，4 ℃條件下鹽析2 h后離心30 min（12 000 r/min），收集上清；繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨粉末至70%的飽和度，4 ℃條件下鹽析12 h后離心30 min （12 000 r/min），收集沉淀；用50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）溶解沉淀后再用2.5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）作透析液，于4 ℃冰箱中透析24 h后，即得初酶液。

1.2.3CM-Sepharose陽(yáng)離子交換層析

先用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）將CM-Sepharose離子交換層析柱平衡好后，取10 mL初酶液上柱，用0～0.5 mol/L的NaCl溶液（用50 mmol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液配制）線性梯度洗脫，流速設(shè)置為0.5 mL/min，每管收集5 mL；測(cè)定各管溶菌酶活力和蛋白含量，收集活性較高的酶液，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4Superdex-200凝膠過(guò)濾層析

用生理鹽水將Superdex-200層析柱水平衡好后，取1.2.3節(jié)中收集的樣品4 mL上柱，用生理鹽水洗脫，流速設(shè)置為0.3 mL/min，每管收集3 mL；測(cè)定各管溶菌酶活力和蛋白含量，收集酶活性較高的幾管樣品，4 ℃條件下透析脫鹽24 h，冷凍干燥后即得牛腎溶菌酶純品，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5溶菌酶活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9-10]方法（稍作改動(dòng)）測(cè)定：采用濁度法[11]。用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）配制底物溶壁微球菌混懸液，調(diào)至光密度（OD450 nm）值在1.3左右。將底物溶壁微球菌懸液于25 ℃水浴中保溫，取2.6 mL底物懸液，0.1 mL溶菌酶酶液，混勻后測(cè)定OD450 nm值，記下反應(yīng)15 s和75 s時(shí)的讀數(shù)OD1和OD2。測(cè)量條件下，每分鐘OD450 nm下降0.001記為一個(gè)酶活力單位（U）。酶活力計(jì)算見(jiàn)下式。

1.2.6牛腎溶菌酶純度鑒定及分子質(zhì)量測(cè)定

用SDS-PAGE鑒定1.2.4節(jié)獲得的牛腎溶菌酶的純度及測(cè)定其亞基分子質(zhì)量，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣10 μL樣品，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)得牛腎溶菌酶亞基分子質(zhì)量。用凝膠過(guò)濾層析法計(jì)算牛腎溶菌酶全分子質(zhì)量[11]。

1.2.7蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)染料法與紫外分光光度法測(cè)定[11]。

1.2.8牛腎溶菌酶的部分酶學(xué)性質(zhì)

1.2.8.1牛腎溶菌酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

在不同溫度（25～85 ℃，間隔10 ℃）下測(cè)定溶菌酶的酶活力，計(jì)酶活力最高值為100%，測(cè)定各溫度下的相對(duì)酶活力，以確定牛腎溶菌酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液分別置于不同溫度（25～85 ℃，間隔10 ℃）下保溫5、6、8、10、12 h，測(cè)定牛腎溶菌酶的酶活力，計(jì)保溫5 h時(shí)測(cè)得的酶活力為100%，計(jì)算各溫度下溫育不同時(shí)間的相對(duì)酶活力，以研究牛腎溶菌酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8.2牛腎溶菌酶的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

在不同pH值（3.0～10.6）的緩沖體系（用不同pH值的緩沖液配制的底物混懸液）中測(cè)定牛腎溶菌酶的酶活力，計(jì)最高酶活力值為100%，測(cè)定各pH值條件下的相對(duì)酶活力，以確定牛腎溶菌酶的最適反應(yīng)pH值。將酶液分別與等體積不同pH值的緩沖液混合后，室溫孵育1 h，在1.2.5節(jié)定義條件下測(cè)定酶活力，計(jì)酶活力最高值為100%，測(cè)定各不同pH值緩沖液孵育后酶液的相對(duì)活力，以研究牛腎溶菌酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.8.3牛腎溶菌酶米氏常數(shù)（Km）的測(cè)定

最適反應(yīng)條件（65 ℃，pH 9.0）下，以不同質(zhì)量濃度的溶壁微球菌（50～400 μg/mL）作為底物，測(cè)定牛腎溶菌酶的酶活力，并采用雙倒數(shù)作圖法[12]，求得牛腎溶菌酶的Km值。

1.2.8.4不同有機(jī)溶劑對(duì)牛腎溶菌酶活性的影響

將酶液分別與不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇、異丙醇等體積混合，常溫孵育30 min，分別測(cè)定各條件下的酶活力，以等體積雙蒸水稀釋后該酶活力為100%，計(jì)算各條件下牛腎溶菌酶的相對(duì)酶活力。

1.2.8.5不同化合物對(duì)牛腎溶菌酶活性的影響

將酶液分別與不同濃度的硫氰化鉀（KSCN）、抗壞血酸、尿素、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、SDS等體積混合，常溫孵育30 min，分別測(cè)定酶活力，以等體積雙蒸水稀釋后該酶的活力為100%，計(jì)算各條件下該酶的相對(duì)酶活力。

1.2.8.6部分金屬離子對(duì)牛腎溶菌酶活性的影響

將酶液分別與等體積不同濃度的金屬離子（Zn2+、Co2+、Mg2+、Ag+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Li＋、Pb2+）混合，常溫下孵育30 min，分別測(cè)定酶活力，以等體積雙蒸水稀釋后酶液的活力為100%，計(jì)算各條件下該酶的相對(duì)酶活力。

2　結(jié)果與分析

2.1牛腎溶菌酶的分離純化

圖1　牛腎溶菌酶的CM-Sepharose陽(yáng)離子交換層析圖譜Fig.1 CM-Sepharose ion-exchange chromatography of lysozyme from bovine kidney

圖1為牛腎溶菌酶的CM-Sepharose陽(yáng)離子交換層析結(jié)果，酶活力峰主要集中于第34～42管，酶活力最高管是第36管；如圖2所示，離子交換層析后收集的樣品經(jīng)Superdex-200凝膠層析后，酶活力峰主要集中在第46～54管，酶活力最高管是第49管；純化后的牛腎溶菌酶通過(guò)SDS-PAGE分析，顯示為單一條帶（圖3），證明牛腎溶菌酶經(jīng)純化后達(dá)到了電泳純。表1為牛腎溶菌酶的整個(gè)分離純化結(jié)果，最終得到牛腎溶菌酶的回收率為29.13%，純化倍數(shù)為231.05，酶比活力為15 145.63 U/mg。

圖2　牛腎溶菌酶的Superdex-200凝膠過(guò)濾層析圖譜Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of lysozyme from bovine kidney

表1　牛腎溶菌酶的純化結(jié)果Table 1 Summary of purification of bovine kidney lysozyme

2.2牛腎溶菌酶的純度及分子質(zhì)量

純化后的牛腎溶菌酶經(jīng)SDS-PAGE分析顯示為單一條帶（圖3），經(jīng)測(cè)定該酶亞基分子質(zhì)量約為12.66 kD；Superdex-200凝膠過(guò)濾層析測(cè)得牛腎溶菌酶的全分子質(zhì)量為12.43 kD，由此可推斷該酶是單亞基酶。

圖3　牛腎溶菌酶的SDS-PAGEE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of lysozyme from bovine kidney

2.3牛腎溶菌酶的部分酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1牛腎溶菌酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖4　溫度對(duì)牛腎溶菌酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of lysozyme from bovine kidney

如圖4所示，25～65 ℃時(shí)，酶活力隨溫度升高呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度高于65 ℃時(shí)酶活力隨溫度升高而呈下降趨勢(shì)，因此該酶最適溫度為65 ℃，其溫度作用范圍廣，在85 ℃條件下其相對(duì)酶活力仍保持在40.5%。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，該酶在25～65 ℃范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，耐高溫，其在75 ℃條件下保溫12 h后其相對(duì)酶活力仍保持在51.61%，該酶在85 ℃保溫12 h后，酶活完全喪失。溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率有兩方面影響，包括：一是反應(yīng)速率會(huì)隨溫度升高而增快，這與一般化學(xué)反應(yīng)無(wú)異；其二，酶（核酸酶除外）作為一種蛋白質(zhì)，隨著溫度的升高酶會(huì)逐漸變性，從而降低酶反應(yīng)速率。當(dāng)?shù)陀谧钸m溫度時(shí)，以前一種效應(yīng)為主，當(dāng)高于最適溫度時(shí)，則以后一種效應(yīng)為主[13]。

圖5　牛腎溶菌酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of lysozyme from bovine kidney

2.3.2牛腎溶菌酶的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖6　pH值對(duì)牛腎溶菌酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of lysozyme from bovine kidney

如圖6所示，該酶的最適pH值為9.0，當(dāng)pH值高于9.0時(shí)，其酶活急劇下降。圖7為pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示該酶在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)活力均保持在較高水平（58.32%以上），且該酶在酸性環(huán)境中更為穩(wěn)定，在pH值小于7的酸性條件下孵育1 h后，該酶的相對(duì)酶活力均高于73.65%。綜合以上結(jié)果可推測(cè)，測(cè)定該酶最適pH值時(shí)，pH值對(duì)底物的影響起主要作用，由于底物溶壁微球菌在不同的pH值條件下呈現(xiàn)不同的狀態(tài)（如活細(xì)菌數(shù)量），從而影響該酶活力[14]，另外，可能與底物混懸液的均勻度有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)混懸液中細(xì)胞集合成團(tuán)塊時(shí)，一部份底物很難被溶菌酶所作用到[15]。該酶穩(wěn)定性結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)該酶與不同的pH值緩沖液孵育1 h后測(cè)其剩余酶活力時(shí)，此時(shí)pH值對(duì)酶起主要作用，pH值可能是通過(guò)改變酶的帶電狀態(tài)來(lái)影響酶和底物的結(jié)合狀態(tài)；過(guò)酸或過(guò)堿的極致環(huán)境也會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，從而使酶遭到不可逆的破壞，從而使酶活下降[16]。

圖7　牛腎溶菌酶的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH Stability of lysozyme from bovine kidney

2.3.3牛腎溶菌酶的米氏常數(shù)（Km）

圖8　雙倒數(shù)法測(cè)定牛腎溶菌酶的米氏常數(shù)Fig.8 Kmdetermination of lysozyme from bovine kidney

如圖8所示，牛腎溶菌酶對(duì)溶壁微球菌的Km值為0.399 μg/mL。

2.3.4不同有機(jī)溶劑對(duì)牛腎溶菌酶活性的影響

圖9　甲醇、乙醇、異丙醇對(duì)牛腎溶菌酶活力的影響Fig.9 Effect of methanol,ethanol and isopropanol on the activity of lysozyme from bovine kidney

如圖9所示，甲醇、乙醇、異丙醇這3 種有機(jī)溶劑對(duì)牛腎溶菌酶均有程度不等的激活作用。有研究表明，有機(jī)溶劑中的酶和水溶液中的酶同樣具備高度的底物選擇性，此外，還可能與下列幾個(gè)特點(diǎn)有關(guān)：有機(jī)溶劑有促使熱力學(xué)平衡向合成方向（如酯合成、肽合成等）移動(dòng)的傾向；以有機(jī)溶劑作為介質(zhì)的條件下，全部有水的副反應(yīng)（如酸酐水解）均會(huì)受到抑制；在有機(jī)溶劑中發(fā)生微生物污染的概率較低；低水環(huán)境可用于穩(wěn)定在水中壽命極短的酶反應(yīng)中間體以及具有未知催化性質(zhì)的構(gòu)象異構(gòu)體[17-18]。

2.3.5 不同化合物對(duì)牛腎溶菌酶活性的影響

圖10　不同化合物對(duì)牛腎溶菌酶活力的影響Fig.10 Effect of various compounds on the activity of lysozyme from bovine kidney

如圖10所示，SDS對(duì)牛腎溶菌酶有很強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到3 mmol/L時(shí)，酶幾乎完全失活，因?yàn)镾DS作為一種變性劑能夠破壞酶蛋白分子中的疏水鍵和氫鍵，改變酶的空間結(jié)構(gòu)，從而使酶活力降低[19]；KSCN對(duì)牛腎溶菌酶有一定的激活作用，抗壞血酸、EDTA-2Na、尿素對(duì)牛腎溶菌酶影響不大。

2.3.6部分金屬離子對(duì)牛腎溶菌酶活性的影響

圖11　不同金屬離子對(duì)牛腎溶菌酶活力的影響Fig.11 Effect of metal ions on the activity of lysozyme from bovine kidney

如圖11所示，Ag＋、Pb2＋對(duì)該酶抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)離子濃度達(dá)到5 mmoL/L時(shí)，剩余的相對(duì)酶活力分別為29.41%、47.06%，Co2＋對(duì)該酶抑制作用次之；低濃度的Fe3＋對(duì)該酶有一定的激活作用，隨著濃度升高其抑制作用也增加，這可能是由于Fe3＋的濃度會(huì)影響該酶本身的帶電量，當(dāng)Fe3＋濃度較低時(shí)，對(duì)酶蛋白帶電量影響微弱，酶分子空間結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，并能促進(jìn)底物與酶活性中心的結(jié)合，形成底物-酶-金屬離子復(fù)合物，因而酶活性增強(qiáng)；當(dāng)Fe3＋濃度增大時(shí)，大量Fe3＋聚集改變了酶蛋白自身的帶電情況影響了酶分子的空間構(gòu)型，從而酶活性逐漸受到抑制[20]。

3　討 論

本實(shí)驗(yàn)以廉價(jià)易得，一年四季均可取材的牛腎為原材料，經(jīng)一系列的純化步驟得到了電泳純的牛腎溶菌酶，純化效果較好，其結(jié)果顯示：酶比活力15 145.63 U/mg，純化倍數(shù)231.05，回收率29.13%。利用此法分離純化溶菌酶步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，其回收率和純化倍數(shù)均較高?；厥章屎图兓稊?shù)均高于豬腎（16.89%、113.6）[21]、鴨卵清（28%、109.44）[22]、苦瓜（3.91%、164.61）[23]，回收率低于菜心（34.1%），但純化倍數(shù)高于菜心（197.4）[24]。

該酶最適溫度為65 ℃，相比于藏綿羊腎（45 ℃）[25]、微生物（40 ℃）[26]、海參腸（35 ℃）[27]有很大差異，說(shuō)明不同來(lái)源的溶菌酶其酶活性質(zhì)也有所不同，這可能是由于生物體為了能滿(mǎn)足生長(zhǎng)代謝的需求、更好地適應(yīng)周?chē)沫h(huán)境而表現(xiàn)出來(lái)的生物特異性，此為生物體基因不斷進(jìn)化并選擇性表達(dá)的結(jié)果[28]。該酶最適pH值為9.0與菜心（5.8）[24]、海洋微生物（8.0）[29]、雞蛋清（7.0）[30]、無(wú)花果（4.6）[21]、橡膠（5.0）[21]、木瓜（4.5）[21]來(lái)源的溶菌酶相比有較大相異。

本實(shí)驗(yàn)純化的牛腎溶菌酶溫度作用范圍廣，在85 ℃條件下其酶活力仍保持在40%以上，且耐熱性好，在25～65 ℃范圍內(nèi)保溫12 h，其酶活仍保持在74.42%以上。耐酸堿，該酶在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)均能保持較高的酶活力（58.32%以上）。結(jié)果顯示該酶在酸性環(huán)境中更加穩(wěn)定，這與已有研究結(jié)果：溶菌酶在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定[31-32]相吻合。通過(guò)以上比較可發(fā)現(xiàn)，牛腎來(lái)源的溶菌酶相比于已有研究的溶菌酶，具有耐高溫、耐酸堿的優(yōu)勢(shì)，此類(lèi)酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的天然溶菌酶具有極廣泛的應(yīng)用前景。

已有研究報(bào)道，溶菌酶的分子質(zhì)量范圍一般在14～18 kD。綠豆溶菌酶和雞蛋溶菌酶的分子質(zhì)量都在14.4 kD左右[33]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牛腎溶菌酶分子質(zhì)量約為12.66 kD，小于豬腎（15 kD）[21]、海參腸（16 kD）[27]，遠(yuǎn)小于海洋微生物溶菌酶（39 kD）[29]。牛腎溶菌酶對(duì)底物溶壁微球菌的Km值為0.399 μg/mL，遠(yuǎn)小于豬腎（13.5 mg/mL）、鴨卵清（86.4 μg/mL）、菜心（87 μg/mL），結(jié)果顯示來(lái)源于牛腎的溶菌酶對(duì)溶壁微球菌有更好的親和力。

甲醇、乙醇、異丙醇對(duì)牛腎溶菌酶活性均有不同程度的激活作用，這與之前報(bào)道的甲醇、乙醇、異丙醇會(huì)抑制鴨卵清溶菌酶的活性，且抑制強(qiáng)度隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增強(qiáng)[33]完全不同。一直以來(lái)，人們普遍認(rèn)為“生物催化反應(yīng)必須在水中進(jìn)行”、“有機(jī)溶劑為酶的失活劑、變性劑”，直至1984年，Zaks等[34]提出這一觀點(diǎn)：只要在合適的條件下，酶在作為非生物體系的有機(jī)溶劑中一樣具備催化功能，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是對(duì)此理論的又一印證。酶作為催化劑已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕紡、洗滌業(yè)、精細(xì)化工、有機(jī)合成等領(lǐng)域，其一般是在水溶液環(huán)境中發(fā)揮催化活性，但在這些領(lǐng)域中的許多有價(jià)值的產(chǎn)品通常是不溶的，目前酶工程正是利用改造酶本身或改造反應(yīng)介質(zhì)來(lái)解決這一難題[35]，而牛腎來(lái)源的溶菌酶與某些有機(jī)溶劑具有良好的配伍性能這一天生優(yōu)勢(shì)恰好能滿(mǎn)足后一種需求，為了更好利用牛腎溶菌酶的這一特性，還需對(duì)該酶非水酶學(xué)性質(zhì)作進(jìn)一步探究。

金屬離子對(duì)牛腎溶菌酶活性有一定的影響，它可通過(guò)對(duì)酶去折疊及折疊的方式影響酶活性大小[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ag＋、Pb2＋、Mg2＋、Co2＋對(duì)該酶均有不同程度的抑制作用，這與鴨卵清[19]和雞蛋清[27]中關(guān)于Mg2＋抑制溶菌酶活性相一致，與Ag＋抑制海洋微生物溶菌酶活性的報(bào)道相符。而與Cu2＋、Zn2＋可抑制雞蛋清、鴨卵清、海洋微生物溶菌酶不同的是，這兩種離子對(duì)牛腎溶菌酶活性無(wú)顯著影響。由此說(shuō)明，來(lái)源不同的溶菌酶其酶活性質(zhì)有顯著差異。

通過(guò)以上分離純化結(jié)果初步證明可考慮將牛腎作為一種全新的溶菌酶來(lái)源投入生產(chǎn)；通過(guò)對(duì)牛腎溶菌酶部分酶學(xué)性質(zhì)的初探及對(duì)不同來(lái)源的溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)的比較，發(fā)現(xiàn)其與已有的溶菌酶有很大的酶學(xué)性質(zhì)差異：對(duì)溫度、酸堿比較穩(wěn)定、與化合物、有機(jī)溶劑等都具有良好的配伍性能，由此決定了其不同的實(shí)際用途。因此為了更好地開(kāi)發(fā)和利用牛腎溶菌酶，還有待在其酶學(xué)結(jié)構(gòu)和抗菌功能上作進(jìn)一步研究。

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Isolation,Purification and Partial Characterization of Lysozyme from Bovine Kidney

FU Ting,WAN Ji,WANG Dan,TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region,Ministry of Education,KeyLaboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development,Ministry of Education,School of Life Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Abstract:Electrophoretically pure lysozyme from bovine kidney was obtained through homogenization,buffer extraction,butanol degreasing,ammonium sulfate fractionation precipitation,CM-Sepharose ion-exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration chromatography.Results showed that the specific activity of the purified lysozyme was 15 145.63 U/mg with a recovery rate of 29.13% and the enzyme was purifi ed 231.05 folds.The molecular weight of the lysozyme was approximately 12.66 kD,which consisted of a single subunit.The optimum temperature of the enzyme was 65 ℃ and it was stable at temperatures below 65 ℃; the optimum pH of this enzyme was 9.0 and it was stable in the range of pH 3.0–9.0.Its Kmtowards micrococcus lysodeikticus was 0.399 μg/mL.The enzyme activity was enhanced by methanol,ethanol,isopropanol and KSCN,and inhibited by SDS,Pb2+,and Ag+.

Key words:bovine kidney; lysozyme; isolation and purifi cation; enzymatic properties

中圖分類(lèi)號(hào)：Q946.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）05-0126-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605023 [17]居乃琥.21世紀(jì)酶工程研究的新動(dòng)向[J].工業(yè)微生物,2001(1):37-45.10.3969/j.issn.1001-6678.2001.01.011.

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：傅婷（1990—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：futing3526@126.com

基金項(xiàng)目：重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC2011AB1027）

收稿日期：2015-04-26