袁清霞，吳 凡，邱麗淳，葉 紅，王曉晴，曾曉雄（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

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鼎湖鱗傘菌胞外多糖在體外3 種模擬消化液中的消化作用

袁清霞，吳 凡，邱麗淳，葉 紅，王曉晴，曾曉雄*
（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

摘 要：從鼎湖鱗傘菌發(fā)酵液中提取、純化得到胞外多糖（Pholiota dinghuensis Bi exopolysaccharides，PDEPS）-1，采用體外模擬唾液、胃液、胃腸液模型與分析還原糖含量、分子質(zhì)量變化及游離單糖含量，探討了PDEPS-1在體外模擬消化液中的變化。結果表明：PDEPS-1的中性糖含量為97.97%，含少量蛋白、糖醛酸及硫酸基，不含還原糖，分子質(zhì)量為17.95 kD，由甘露糖及半乳糖組成，物質(zhì)的量比為53.32∶6.43。PDEPS-1在唾液中不被消化，分子質(zhì)量不變，沒有還原糖及單糖的生成；在模擬胃液及胃腸液中有還原糖產(chǎn)生，但沒有檢測到單糖。因此，PDEPS-1在體外模擬的3 種消化液中具有一定的耐消化性。

關鍵詞：鼎湖鱗傘菌；胞外多糖；體外消化；還原糖；分子質(zhì)量；單糖

引文格式：

袁清霞,吳凡,邱麗淳,等.鼎湖鱗傘菌胞外多糖在體外3 種模擬消化液中的消化作用[J].食品科學,2016,37(5):72-77.

YUAN Qingxia,WU Fan,QIU Lichun,et al.Effects of three digestive juices on the in vitro digestion of exopolysaccharide from Pholiota dinghuensis Bi[J].Food Science,2016,37(5):72-77.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605014.http://www.spkx.net.cn

多糖廣泛存在于植物、動物、微生物中，越來越多的研究顯示多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，且毒副作用小[1-3]。此外，多糖作為人類日常飲食的重要構成部分，研究表明其大部分在腸道中被微生物利用，代謝過程產(chǎn)氣及生成短鏈脂肪酸[4]。已有研究證實在體外人糞樣厭氧發(fā)酵模型中，多糖能有效促進短鏈脂肪酸的生成，促進有益微生物如雙歧桿菌、乳桿菌等的生長[5-7]。但由于體內(nèi)消化研究的復雜性，對多糖在唾液及胃腸道消化液中的消化、吸收情況知之甚少。近年來，體外模擬胃腸液消化模型由于具有簡單易行、成本低、重復性好等優(yōu)點廣泛用于分析多糖在消化液中的變化[8-9]。

鼎湖鱗傘菌（Pholiota dinghuensis Bi）為中國特有種，是Pholiota屬中的一個新種，發(fā)現(xiàn)于我國廣東省，由畢志樹等[10]于1985年最早報道，2008年被收入到“Dictionary of the Fungi”中[11]。本實驗室前期的研究表明，鼎湖鱗傘菌絲體多糖具有顯著的抗腫瘤活性[12]，此外還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[13]。但對其胞外多糖的研究較少，尚未見有關鼎湖鱗傘菌胞外多糖（Pholiota dinghuensis Bi exopolysaccharides，PDEPS）體外消化的研究報道。因此，本實驗利用體外模擬唾液、胃液、胃腸液模型探討鼎湖鱗傘菌胞外多糖的消化情況，為進一步研究鼎湖鱗傘菌胞外多糖對腸道微生物的調(diào)節(jié)作用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1菌種與試劑

鼎湖鱗傘菌（Pholiota dinghuensis Bi）來源于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、葡萄糖醛酸、核糖、木糖、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、乙腈美國Sigma公司；鼠李糖、巖藻糖 阿拉丁試劑（上海）有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS） 國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶 北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

EPED-E2-10TH型實驗室級超純水器 南京易普易達科技發(fā)展有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇常州國華電器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；V-1200型可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1PDEPS的制備

按Gan Dan等[14]報道的方法培養(yǎng)鼎湖鱗傘菌。鼎湖鱗傘菌發(fā)酵液過濾、沖洗后合并濾液，減壓濃縮，加入3 倍體積無水乙醇醇沉，離心得沉淀，干燥后得PDEPS粗品。PDEPS粗品經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow凝膠陰離子交換柱及Sephadex G-100凝膠過濾柱純化得到純化組分PDEPS-1。

1.3.2PDEPS-1的表征

苯酚-硫酸法[15]測定中性糖含量；考馬斯亮藍法[16]測定蛋白質(zhì)含量；間羥聯(lián)苯法[17]測定糖醛酸含量；氯化鋇-明膠比色法[18]測定硫酸基含量；DNS法[19]測定還原糖含量；高效液相凝膠過濾色譜法[3]（high performance gel filtration chromatography，HPGFC）測定PDEPS-1的純度及分子質(zhì)量；單糖組成分析參考Dai Jun等[20]的方法進行。

1.3.3PDEPS-1的體外消化

1.3.3.1模擬唾液對PDEPS-1的消化作用

新鮮唾液樣品的采集參考文獻[21]?？谇坏哪M消化參考文獻[22]。PDEPS-1溶解于超純水中配制成2 mg/mL的溶液，A、B、C管中分別加入2 mL唾液和2 mL多糖、2 mL唾液和2 mL超純水、2 mL多糖和2 mL超純水。測試管置于37 ℃水浴鍋中反應，在反應0、4、6 h后分別取出部分反應液，沸水浴10 min滅酶活。DNS法測定唾液消化后多糖中還原糖的含量；HPGFC法測定消化后多糖分子質(zhì)量的變化，色譜柱為TSK-gel G4000 PWXL（7.8 mm×300 mm，10 ?m），流動相為純水，流速為0.7 mL/min，柱溫35 ℃，檢測器為示差檢測器，進樣20 ?L；PMP單糖衍生法檢測消化后產(chǎn)生的單糖，色譜柱為Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為0.1 mol/L pH 6.7磷酸鹽緩沖液與乙腈的混合液（83∶17，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長245 nm，進樣20 ?L。

1.3.3.2模擬胃液對PDEPS-1的消化作用

體外模擬胃液的配制參考文獻[23]。向裝有體外模擬胃液的離心管中加入PDEPS-1多糖溶液，另設一組空白對照，該離心管中以相同體積的超純水代替多糖溶液。所有離心管于37 ℃、150 r/min的搖床中消化，分別于0、4、6 h取樣，沸水浴10 min滅酶活。HPGFC法測定消化后的多糖分子質(zhì)量變化，色譜條件同1.3.3.1節(jié)；以1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至7，DNS法測定消化后多糖中還原糖的含量；PMP單糖衍生法檢測消化后產(chǎn)生的單糖，色譜條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.3模擬胃腸液對PDEPS-1的消化作用

體外模擬腸液的配制參考文獻[23]。體外模擬胃液消化多糖6 h后，以1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至7，加入一定體積的模擬腸液，混勻后，37 ℃、150 r/min的搖床中消化。分別于消化的0、4、6 h取樣，沸水浴10 min滅酶活。DNS法測定唾液消化后多糖中還原糖的含量；HPGFC法測定消化后的多糖分子質(zhì)量變化，色譜條件同1.3.3.1節(jié)；PMP單糖衍生法檢測消化后產(chǎn)生的單糖，色譜條件同1.3.3.1節(jié)。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結果與分析

2.1PDEPS-1的制備與理化性質(zhì)

將培養(yǎng)的鼎湖鱗傘菌發(fā)酵液過濾、濃縮、醇沉、干燥，制備得到PDEPS粗品。PDEPS粗品經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow凝膠陰離子交換柱獲得3 個組分，分別為水洗脫組分F1、0.1 mol/L NaCl洗脫組分F2和0.3 mol/L NaCl洗脫組分F3（圖1a），其中F1為主要組分。將主要組分F1進一步經(jīng)Sephadex G-100純化得到純化組分PDEPS-1，結果如圖1b所示。

圖1　PDEPS粗品在DEAE Sepharose Fast Flow柱的梯度洗脫曲線（a）及PDEPS-1在Sephadex G-100柱上的洗脫曲線（bb）Fig.1 Stepwise elution curve of crude PDEPS on DEAE Sepharose Fast Flow column(a)and elution curve of PDEPS-1 on Sephadex G-100 column(b)

PDEPS-1的理化性質(zhì)結果見表1。PDEPS-1的中性糖含量為97.97%，蛋白質(zhì)、糖醛酸及硫酸基含量較少，不含還原糖，說明PDEPS-1為中性糖。以不同分子質(zhì)量的P-系列普魯蘭多糖標準品，通過HPGFC法繪制分子質(zhì)量的標準曲線，并進行線性回歸，回歸方程為Y＝－0.361 2X＋9.008 5（R2＝0.998 2），其中，X代表保留時間，Y代表標準多糖分子質(zhì)量的對數(shù)值（lgMw）。將PDEPS-1的保留時間代入標準曲線回歸方程，計算得其平均分子質(zhì)量為17.95 kD。標準單糖PMP衍生物的HPGFC色譜圖如圖2a所示，標準單糖在色譜圖上的保留時間依次為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及巖藻糖。PDEPS-1單糖組成的HPGFC色譜圖如圖2b所示，PDEPS-1由甘露糖及半乳糖組成，根據(jù)各種單糖的回歸方程及PDEPS-1單糖的峰面積計算得甘露糖和半乳糖的物質(zhì)的量比為53.32∶6.43。

表1　PDEPS-1的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of PDEPS-1

圖2　單糖混合標準品（a）與PDEPS-1單糖組成（b）的HPLLCC圖Fig.2 HPLC chromatograms of standard monosaccharides(a)and PDEPS-1(b)

2.2PDEPS-1的體外消化

2.2.1體外消化產(chǎn)物的還原糖含量

在PDEPS-1體外消化產(chǎn)物的還原糖測定實驗中，本實驗采用DNS法分別測定了不加PDEPS-1的唾液、胃液、腸液及胃腸液中的還原糖含量，結果發(fā)現(xiàn)胃液中含少量還原糖（0.7 mg/mL）。為消除消化液自身所含還原糖對結果的影響，本研究以消化液為參比溶液來檢測PDEPS-1體外模擬消化液消化產(chǎn)物的還原糖含量，結果如表2所示。PDEPS-1最初不含還原糖。唾液消化后沒有產(chǎn)生還原糖，這與文獻報道的結果一致[9,24]。在模擬胃液中，隨消化時間的增加，還原糖含量逐漸增加，說明在胃液中，較低的pH值可能導致部分糖苷鍵的斷裂。而在模擬胃腸液中，隨時間增加，還原糖變化不大。

表2　PDEPS-1體外消化產(chǎn)物的還原糖含量（x±s，n　==　33）Table 2 Reducing sugar contents in digested products of PDEPS-1 x ,= 3)

2.2.2PDEPS-1消化產(chǎn)物分子質(zhì)量的變化

圖3　PDEPS-1在不同消化時間點的HPGPPCC圖Fig.3 HPGPC chromatograms of PDEPS-1 at different digestion times

中性多糖主要通過羥基的分子間氫鍵形成聚集體，不同的處理包括溶劑、超聲、過濾等都會影響多糖聚集的生成及分子質(zhì)量分布[25]。由圖3可知，當PDEPS-1溶液與唾液、胃液、胃腸液這3 種消化液混合后，相對于水溶液體系，PDEPS-1的分子質(zhì)量分布沒有發(fā)生變化，說明消化液中的自由離子不會影響PDEPS-1的分子質(zhì)量分布。這與張冠亞等[9]的研究結果一致。在唾液消化過程中，PDEPS-1的分子質(zhì)量沒有發(fā)生明顯改變（圖3a），同時沒有還原糖的生成，說明PDEPS-1在唾液中沒有被消化。PDEPS-1在胃液及胃腸液中反應4、6h后，分子質(zhì)量無明顯變化，這與還原糖含量的測定結果一致。在胃液中，雖然隨著時間的增加，還原糖含量有所增加，但總體而言，生成的還原糖較少，推測糖苷鍵的斷裂程度較輕，分子質(zhì)量變化不大。

2.2.3PDEPS-1消化產(chǎn)物游離單糖的分析

圖4　PDEPS-1體外模擬消化液消化后PMP衍生化的HPLLCC圖Fig.4 HPLC chromatograms of free monosaccharides from in vitro digestion of PDEPS-1

由圖4a、4b可知，B管的唾液與超純水混合液衍生后并沒有單糖的峰，說明唾液自身不含單糖。唾液與多糖混合消化6 h后取樣進行衍生，同樣沒有檢測到單糖，這與還原糖含量、分子質(zhì)量變化的測定結果一致。胃液空白組衍生后出現(xiàn)葡萄糖的峰，說明胃蛋白酶或胃脂肪酶中含一定量的葡萄糖（圖4d），這與2.2.1節(jié)的測定結果一致。PDEPS-1在胃液中消化6 h后，色譜圖中仍然只有一個葡萄糖的峰（圖4c），且峰面積沒有發(fā)生變化，并沒有檢測到組成PDEPS-1的甘露糖或半乳糖，說明胃液消化后也沒有單糖的產(chǎn)生。圖4e是腸液衍生后的色譜圖，沒有任何單糖峰出現(xiàn)，說明腸液中不含單糖。胃液與腸液混合衍生后，胃液中的葡萄糖被稀釋，峰變?。▓D4g）。PDEPS-1在胃腸液中消化6 h后，葡萄糖的峰不變（圖4f），說明PDEPS-1在唾液、胃液、胃腸液消化過程中并沒有游離單糖的產(chǎn)生。

3　結 論

通過發(fā)酵鼎湖鱗傘菌獲得鼎湖鱗傘菌發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)提取與純化得到純化組分PDEPS-1。PDEPS-1為一種中性多糖，由甘露糖及半乳糖組成，分子質(zhì)量為17.95 kD。PDEPS-1在模擬唾液中消化沒有還原糖的生成，也沒有單糖生成，分子質(zhì)量不變；在胃液中消化后檢測到少量還原糖，分子質(zhì)量基本不變，沒有檢測到單糖，PDEPS-1在模擬胃腸液中還原糖含量基本不變，分子質(zhì)量無明顯變化，仍然沒有檢測到單糖。這些結果表明PDEPS-1在體外模擬的3 種消化液中比較穩(wěn)定，說明PDEPS-1具有一定的耐消化性。

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Effects of Three Simulated Digestive Juices on in Vitro Digestion of Exopolysaccharide from Pholiota dinghuensis Bi

YUAN Qingxia,WU Fan,QIU Lichun,YE Hong,WANG Xiaoqing,ZENG Xiaoxiong*
(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:Pholiota dinghuensis Bi exopolysaccharides(PDEPS-1)was prepared from the fermentation broth of Pholiota dinghuensis Bi through extraction and purification procedures.The changes of PDEPS-1 in simulated digestive juices were investigated by determining the reducing sugar content,molecular weight,and monosaccharide compositionbefore and after digestion using simulated saliva,gastric juice and gastrointestinal juice model in vitro.The results showed that the content of neutral sugar in PDEPS-1 was 97.97%,and PDEPS-1 also contained small amounts of protein,uronic acid,and sulfuric radical.No reducing sugar was detected in PDEPS-1.The average molecular weight of PDEPS-1 was estimated to be 17.95 kD.It was composed of mannose and galactose in a molar ratio of 53.32:6.43.After digestion in saliva,the molecular weight of PDEPS-1 remained unchanged and neither reducing sugar nor monosaccharides were detected,indicating that PDEPS-1 couldnot be digested in saliva.After digestion,reducing sugar was detected in both simulated gastric juice and gastrointestinal juice,but monosaccharides were not detected.Therefore,the exopolysaccharide PDEPS-1 from Pholiota dinghuensis Bi was resistant to the digestive juices.

Key words:Pholiota dinghuensis Bi; exopolysaccharide; in vitro digestion; reducing sugar; molecular weight; monosaccharide

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0072-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605014 1 0.7506/spkx1002-6630-201605014.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：曾曉雄（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zengxx@njau.edu.cn

作者簡介：袁清霞（1987—），女，博士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)與功能分析。E-mail：2013208025@njau.edu.cn

基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程基金項目（PAPD）

收稿日期：2015-10-08