姚　艷,馮鵬飛,李曉娜,賀　瑞,陳維毅,王曉君

(1.太原理工大學 a.力學學院,b.應用力學與生物醫(yī)學工程研究所,太原030024;

2.山西省眼科醫(yī)院 準分子激光室,太原 030002)

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周期性牽拉與TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響

姚艷1a,馮鵬飛1b,李曉娜1b,賀瑞2,陳維毅1b,王曉君1a

(1.太原理工大學 a.力學學院,b.應用力學與生物醫(yī)學工程研究所,太原030024;

2.山西省眼科醫(yī)院 準分子激光室,太原 030002)

摘要:利用Flexcell4000柔性基底拉伸系統(tǒng)對角膜成纖維細胞實施應變?yōu)?%或15%、頻率為0.1 Hz的周期性牽拉載荷,用質量濃度為1 ng/mL或10 ng/mL的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)處理,并采用流式細胞儀檢測細胞周期,研究周期性牽拉與TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響。結果表明:5%周期性牽拉或TNF-α單獨作用對正常及圓錐角膜成纖維細胞S期細胞比例均無顯著性影響;15%牽拉使正常及圓錐角膜成纖維細胞S期細胞比例均顯著下降;與正常角膜相比,15%牽拉和TNF-α共同作用使圓錐角膜S期細胞比例下降更顯著。周期性牽拉及TNF-α可能通過抑制圓錐角膜基質細胞增殖參與圓錐角膜的發(fā)生和發(fā)展。

關鍵詞:周期性牽拉;腫瘤壞死因子;圓錐角膜;成纖維細胞;細胞增殖

圓錐角膜是一種原發(fā)性角膜退變性疾病。通常發(fā)生于青春期前后,常表現(xiàn)為雙眼先后進行性發(fā)病,發(fā)病率介于0.05%～0.23%之間,與性別種族無關[1]。目前病因尚不清楚,可能與眼角膜損傷有關[2]。角膜基質細胞是正常角膜基質中的主要細胞成分,在眼角膜未受損傷的情況下,角膜基質細胞處于相對靜止狀態(tài),細胞呈扁平多突起狀,通過細胞突起頂部的縫隙連接與相鄰細胞發(fā)生聯(lián)系。在眼角膜受到損傷時,原本處于靜止狀態(tài)的角膜基質細胞被激活,轉變?yōu)樾迯捅硇?被稱作角膜成纖維細胞。激活后的角膜成纖維細胞遷移到受損傷的角膜基質附近,參與組織修復過程。與角膜基質細胞相比,成纖維細胞的細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,由原來的扁平多突起狀態(tài)轉變成長梭形,細胞功能也發(fā)生顯著變化,細胞合成和分泌細胞外基質的水平大大提高。此時,它的增殖平衡對于角膜的透光性、屈光性及保護、防御功能的發(fā)揮至關重要[3]。

在圓錐角膜疾病發(fā)展過程中,角膜會受到不同程度力的刺激,但角膜成纖維細胞的增殖在力學刺激下是如何響應的,目前尚不清楚。有文獻報道，炎性因子TNF-α在圓錐角膜中的表達明顯增高,它在調節(jié)炎癥反應和調節(jié)細胞生存或死亡方面起著重要作用[4],可能參與了圓錐角膜的發(fā)生和發(fā)展[5-6]。而TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響仍不清楚。在生理環(huán)境中,細胞的增殖會受到多種因素的共同作用。因此,研究周期性牽拉和炎性因子TNF-α單獨或聯(lián)合作用對角膜成纖維細胞增殖的影響十分重要。

本文通過對體外培養(yǎng)的正常人和圓錐角膜患者的角膜成纖維細胞給予周期性機械牽拉和TNF-α處理,研究周期性牽拉和TNF-α對角膜成纖維細胞增殖的影響,進而探究圓錐角膜的發(fā)病原因和發(fā)展機制,為手術治療、術后恢復提供參考和理論依據。

1材料與方法

1.1細胞提取與培養(yǎng)

圓錐角膜和正常角膜均取自于山西省眼科醫(yī)院。圓錐角膜患者1:男,1985年生,2003年被診斷為圓錐角膜,2013年底施左眼角膜移植術。圓錐角膜患者2:男,1997年生,2005年視力開始下降,2012年初被診斷為圓錐角膜,2012年底施左眼角膜移植術,2013年底施右眼角膜移植術。首先機械剝離上皮層和內皮層,然后用2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶消化組織塊,直至培養(yǎng)液完全清亮。離心后獲得角膜成纖維細胞,加入胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)體積分數為10%的F12全血清培養(yǎng)基,置于37 ℃、二氧化碳體積分數為5%的孵箱內培養(yǎng),細胞覆蓋培養(yǎng)皿90%左右時進行傳代。本文研究采用第五代角膜成纖維細胞。文中NC(Normal cornea)代表正常角膜,KC(Keratoconus)代表圓錐角膜。KC1和KC2分別代表患者1、患者2的圓錐角膜。

1.2細胞周期性牽拉及TNF-α處理

采用Flexcell4000柔性基底拉伸系統(tǒng)(美國Flexcell)對角膜成纖維細胞實施周期性機械牽拉。該系統(tǒng)通過真空泵產生的負壓抽吸特制的柔性培養(yǎng)膜,使黏附生長在培養(yǎng)膜上的細胞受到周期性牽拉作用。整個加載裝置放置于培養(yǎng)箱內,加載程序由Flexcell4000計算機軟件自動控制。本文采用應變?yōu)?%和15%，頻率為0.1 Hz的正弦波周期性力學加載來模擬角膜受力。

角膜成纖維細胞用質量分數為0.25%的胰蛋白酶消化,以3×105mL-1的細胞密度接種于裱襯有I型膠原蛋白的BioFlex彈性膜六孔培養(yǎng)板(美國Flexcell)上,置于孵箱內培養(yǎng)。待細胞80%融合時,換成不含F(xiàn)BS的DMEM/F12(Dulbecco′s Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F-12)培養(yǎng)基進行饑餓處理。12 h后添加含TNF-α(質量濃度分別為0，1，10 ng/mL)的全血清培養(yǎng)基,同時進行周期性力學加載,以靜態(tài)培養(yǎng)組(未施加載荷)作為對照,每組重復3次實驗。12 h后收集細胞,采用流式細胞儀檢測細胞周期，觀察細胞增殖情況。本研究中TNF-α質量濃度的選擇參考了以前文獻中所采用的TNF-α質量濃度[7-9]。

1.3細胞周期檢測

用PBS清洗細胞,然后用質量分數0.25%的胰蛋白酶消化，再加入FBS體積分數為10%的F12培養(yǎng)基終止消化,并吹打成單細胞懸浮。1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入預冷的70%乙醇,采用流式細胞儀進行細胞周期檢測。本文以S期細胞百分比變化情況考察細胞增殖情況。

1.4統(tǒng)計學分析

2結果

NC:Normal cornea; KC:Keratoconus圖1　單獨周期性牽拉對人角膜成纖維細胞增殖的影響Fig.1　The effects of cyclic stretch on human corneal fibroblasts

流式細胞儀檢測圖中，橫坐標為熒光信號強度(用道數表示),與DNA含量成正比;縱坐標表示相對細胞數；第一峰為G1期細胞,第二峰為S期細胞(圖1)。由圖1可知,靜態(tài)培養(yǎng)條件下,NC，KC1，KC2組角膜成纖維細胞處于S期細胞的比例無顯著性差異。單獨周期性牽拉12 h后,與靜態(tài)組相比,5%周期性牽拉對NC，KC1，KC2組處于S期的細胞比例無顯著性影響；15%周期性牽拉時NC，KC1，KC2組處于S期的細胞比例顯著下降(P<0.05),這說明高應變條件下角膜成纖維細胞增殖受到抑制。

靜態(tài)培養(yǎng)下,加入1 ng/mL或10 ng/mL TNF-α時,NC，KC1，KC2的S期細胞數比例有所下降,但無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。這說明TNF-α單獨作用對正常及圓錐角膜成纖維細胞增殖均無顯著性影響。

圖2　TNF-α對人角膜成纖維細胞增殖的影響Fig.2　The effects of TNF-α on the proliferationof human corneal fibroblasts

5%周期性牽拉和TNF-α聯(lián)合作用12 h后,NC，KC1組處于S期的細胞比例與靜態(tài)對照組比較無顯著性差異(P>0.05);與靜態(tài)對照組比較,KC2組S期的細胞比例顯著下降(P<0.05),且各組之間無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

當牽拉應變?yōu)?5%時,添加1 ng/mL或10 ng/mL TNF-α后,NC，KC1，KC2組處于S期的細胞比例下降,且與NC組比較,KC組S期細胞比例下降更顯著(P<0.05),KC組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖3、表1)。這表明,15%周期性牽拉與TNF-α聯(lián)合作用對角膜成纖維細胞增殖無協(xié)同效應,高應變和TNF-α共同作用時抑制角膜成纖維細胞增殖,且對圓錐角膜成纖維細胞增殖抑制更顯著。

表1　15%牽拉下KC組與NC組細胞增殖顯著性差異分析

3討論

圓錐角膜屬于角膜病的一種,對視力有嚴重的影響,可導致失明。但其發(fā)生發(fā)展的機理尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，該疾病可能與隱形眼鏡磨損和揉眼等機械性創(chuàng)傷有關[10]。而機械性創(chuàng)傷在導致人角膜力學微環(huán)境改變[11]的同時還使角膜中TNF-α因子表達增加[12]。但關于力學因素和TNF-α對人角膜成纖維細胞增殖的影響尚未見相關報道。

本文對正常角膜成纖維細胞和圓錐角膜成纖維細胞施加頻率為0.1 Hz、應變?yōu)?%或15%的周期性牽拉,并添加不同質量濃度的TNF-α處理,12 h后采用流式細胞技術檢測細胞周期。結果表明,高應變抑制角膜成纖維細胞增殖,且對圓錐角膜成纖維細胞增殖抑制更顯著。而成纖維細胞的主要功能是合成細胞外基質,其增殖受到抑制,不利于角膜成纖維細胞外基質的合成,可能使角膜進一步變薄,促進圓錐角膜病程的發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),高幅度牽拉使角膜成纖維細胞中基質金屬蛋白(Matrix metallo proteinases)表達增加[13],表明高應變條件下基質合成受到影響,這與本文研究結果相符。有研究報道，對離體培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞施加拉伸幅度為30%的拉力,48 h后流式細胞儀檢測細胞周期,結果表明一定強度機械應力持續(xù)作用可促進皮膚成纖維細胞增殖[14];頻率為0.1 Hz、應變?yōu)?%的周期性機械拉伸作用24 h和36 h能夠促進兔角膜成纖維細胞增殖[15];對胎鼠肺成纖維細胞施加頻率為1 Hz,拉伸幅度為5%,15 min/h間歇性牽拉24 h,能夠抑制細胞增殖,并誘導其凋亡[16]。不同成纖維細胞在不同力的加載形式下，細胞增殖響應不統(tǒng)一,這可能與應力刺激的大小、頻率、時間、加載形式以及組織來源有關。圓錐角膜成

纖維細胞增殖在不同加載時間、加載方式、加載頻率下是如何響應的,還有待進一步深入研究。

本研究還發(fā)現(xiàn),單獨作用TNF-α對人角膜成纖維細胞增殖無顯著影響,這與Mohan，et al[7]研究結果相一致。而TNF-α可抑制前列腺淋巴結癌(lymph node carcinoma of prostate,LNCaP)細胞的增殖[17],但可以促進人牙齦成纖維細胞的增殖[9],這說明不同來源的成纖維細胞對TNF-α反應有所不同。在TNF-α和5%周期性牽拉聯(lián)合作用時,KC2細胞增殖受到抑制,分析可知,這可能與患者的個體差異及病程有關。圓錐角膜患者1,發(fā)病10 a,病程進展緩慢?；颊?在右眼發(fā)生圓錐角膜1 a后,左眼也迅速發(fā)展成圓錐角膜,屬于急性發(fā)病,因此他的角膜成纖維細胞在受到周期性牽拉和TNF-α作用時變化更顯著。本研究結果還表明,TNF-α與15%周期性牽拉聯(lián)合作用對角膜成纖維細胞增殖無協(xié)同效應。文獻報道，白細胞介素(IL-1β)抑制皮膚微血管細胞和關節(jié)軟骨細胞增殖,力學刺激促進皮膚微血管細胞和關節(jié)軟骨細胞增殖,力學刺激和IL-1β同時作用時則促進其細胞增殖[18-19]。高質量濃度的外源性炎癥介質前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)(100 ng/mL,500 ng/mL)能促進類風濕性關節(jié)炎中成纖維細胞樣滑膜細胞增殖,但力學刺激和PGE2共同作用時對滑膜細胞增殖的下調作用并不明顯[20]?？芍仔砸蜃雍土W刺激在影響細胞增殖時,它們之間的相互作用機制尚不明確。

角膜處在一個復雜的力學環(huán)境之中。本研究表明，在高應變或高應變與TNF-α聯(lián)合作用條件下,角膜成纖維細胞增殖受到抑制,進而影響細胞外基質合成,使角膜進一步變薄,促進圓錐角膜病程的發(fā)展。但角膜成纖維細胞如何感受應力變化和炎性因子,實現(xiàn)增殖調控，這還有待進一步深入研究。參考文獻：

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(編輯：張紅霞)

Effects of Cyclic Stretch and TNF-α on Cell Proliferation of Corneal Fibroblasts

YAO Yan1a,FENG Pengfei1b,LI Xiaona1b,HE Rui2,CHEN Weiyi1b,WANG Xiaojun1a

(1.a.CollegeofMechanics,b.InstituteofAppliedMechanicsandBiomedicalEngineering,TaiyuanUniversityofTechnology，Taiyuan030024,China;2.ExcimerLaserDepartment,ShanxiEyeHospital,Taiyuan030002,China)

Abstract:Corneal fibroblasts isolated from normal corneas and keratoconus in vitro were subjected to cyclic stretch (0.1 Hz,5% or 15% strain) using Flexcell 4000 tension system,in the presence of 1 ng/mL or 10 ng/mL tumor necrosis factor-α (TNF-α). Cell cycle was detected by flow cytometry,to study the effect of cyclic stretch and TNF-α on proliferation of fibroblasts in keratoconus corneas. The experiment result shows that,5% strain orTNF-α had no significant effects on S phase proportion of keratoconus and normal corneal fibroblasts. All groups’ S phase proportions of keratoconus and normal corneal fibroblasts decreased under 15% stretch. Compared with normal corneal fibroblasts,keratoconus fibroblasts decreased in S phase proportion more significantly under the effect of 15% stretch and TNF-α,and there is no difference between keratoconus groups. By this study,we know that cyclic stretch and TNF-α may promote the development of keratoconus by inhibiting the proliferation of corneal stromal cells.

Key words:cyclic stretch;tumor necrosis factor-α;keratoconus;fibroblasts;cell proliferation

中圖分類號:R318.01

文獻標識碼:A

DOI：10.16355/j.cnki.issn1007-9432tyut.2016.01.021

作者簡介：姚艷(1990-)，女，遼寧沈陽人，碩士生，主要從事生物力學研究，(E-mail)yaoyan199001@163.com通訊作者：王曉君(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導師，(E-mail) wangxiaojun@tyut.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目:在體角膜材料生物力學特性研究及基于角膜微結構的建模分析(11402161)， 非糖基化交聯(lián)后基質剛度變化對角膜基質重塑的調控機理研究(11402162); 山西省高等學校教學改革資助項目(J2012014)

收稿日期：2015-03-18

文章編號:1007-9432(2016)01-0108-05