王　霞，公　瑩，李榮貞，張曉杰

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康衛(wèi)氏平皿擴散法定量檢測血液制品中乙醇殘留量

王霞，公瑩，李榮貞，張曉杰＊

［摘要］目的建立定量測定血液制品中乙醇殘留量的方法。方法運用改進的康衛(wèi)氏皿擴散法測定血液制品中乙醇殘留量。結(jié)果本法平均回收率及RSD%分別為101.26%±1.63%，1.61%，線性范圍在0.05399～0.5399 mg/ml，本方法重復性、穩(wěn)定性、準確度較好。結(jié)論康衛(wèi)氏皿擴散法可用作定量檢測血液制品中乙醇殘留量的方法。

［關(guān)鍵詞］血液制品；康衛(wèi)氏皿擴散法；乙醇殘留量

［作者單位］271000山東泰安，山東泰邦生物制品有限公司（王霞，公瑩，李榮貞，張曉杰）

Determination of alcohol residue in blood products by using Conway＇s dish diffusion method

WANG Xia，GONG Ying，LI Rong－zhen，et al.Shandong Taibang Biological Products Co.，Ltd，Taian，Shandong 271000，China

［Abstract］ObjectiveTo establish a method for determination of alcohol residue in blood products.Methods Conway＇s dish diffusion method was adopted for determining alcohol residue.Results In this method the average recovery rate and coefficient of variation were 101.26%±1.63%，1.61%respectively，linearity range was 0.05399－0.5399 mg/ml.This method reproducibility，stability，and accuracy were all showed better.ConclusionCouway＇s dish diffusiou method could be used in detection of alcohol residue in blood products.

［Key words］Blood products；Conway＇s dish diffusion method；Alcohol residue

目前血液制品的生產(chǎn)大都采用低溫乙醇法，但在工藝過程中并不能完全去除殘留乙醇［1－3］。由于殘留乙醇可能增加血液制品的不穩(wěn)定性，且具有不良反應，故對血液制品中的殘留乙醇應進行控制。目前對血液制品中乙醇的殘留檢測主要在制劑生產(chǎn)過程中，對血液制品成品乙醇殘留及半成品定量的檢測鮮有報道。氣相色譜法是測定易揮發(fā)性有機溶劑常用方法，但測定含有蛋白類的復雜水溶液體系中的乙醇殘留量較為困難［4］?？敌l(wèi)氏皿擴散法廣泛應用于食品水分等的檢測［5，6］，本文運用改進的康衛(wèi)氏皿擴散法，利用乙醇在飽和的碳酸鈉溶液中加熱逸出，被重鉻酸鉀－硫酸溶液吸收呈黃綠色至綠色，用比色法對兩種血液制品進行了殘留乙醇定量檢測［7］，方法簡便、準確、重復性好，可用作血液制品中乙醇殘留量的定量檢測。

1　材料與方法

1.1樣品人血白蛋白、靜脈注射人免疫球蛋白（pH4）成品及半成品為山東泰邦生物制品有限公司產(chǎn)品。

1.2主要試劑及儀器TU－1901紫外－可見分光光度計（北京普析），電子分析天平（梅特勒）；無水乙醇（色譜級，批號：20140106，純度＞99.9%），硫酸、重鉻酸鉀、無水碳酸鈉均為分析純（AR），純化水。

1.3溶液配制

1.3.1試劑配制（1）飽和碳酸鈉溶液：等量碳酸鈉溶于等量純化水中。（2）重鉻酸鉀－硫酸溶液：取重鉻酸鉀3.7 g溶于150 ml純化水后加入硫酸280 ml，放冷純化水定容至500 ml。

1.3.2對照溶液配制精密稱取無水乙醇0.5399 g，置于已加入適量純化水的10 ml量瓶中，純化水稀釋定容并搖勻，此為對照儲備液。分別量取對照儲備液1.00、0.80、0.50、0.30、0.10 ml配制濃度分別為0.5399、0.4319、0.2700、0.1620、0.05399 mg/ml的系統(tǒng)對照溶液。

1.4樣品處理精密量取樣品1.5 ml，按藥典2010年版三部附錄ⅥD處理［7］。

1.5測定波長的選擇將對照品溶液在450～800nm波長范圍內(nèi)進行掃描，取重鉻酸鉀硫酸溶液按照1.4項下方法處理作為空白。

1.6標準曲線的繪制取系列對照溶液各1.5 ml，按1.4項下方法處理，以吸光度y對濃度x進行線性回歸。

1.7方法的驗證

1.7.1重復性驗證將1.4項法處理好的人血白蛋白樣品6次進樣檢測，記錄吸光度，計算乙醇殘留量及RSD。

1.7.2穩(wěn)定性試驗將1.4項法處理好的人血白蛋白樣品放置0、4、8、12、16、20 h，取樣進行檢測。

1.7.3準確性驗證配制高、中、低3個濃度水平的標準品：0.22、0.20、0.18 mg/ml，分別取1 ml與已知乙醇殘留量的樣品（編號2人血白蛋白半成品）1 ml混合，按1.4項方法處理并依照上述步驟測定，樣品乙醇含量3次取平均，每個加對照的樣品平行測定3次，計算其回收率及RSD。

1.8方法的初步應用取人血白蛋白、靜脈注射人免疫球蛋白成品及半成品共10批，測定乙醇殘留量。

2　結(jié)果

2.1最大吸收波長（λmax）及線性范圍450～800nm波長范圍內(nèi)掃描得到λmax約為600 nm，這與藥典給出的測定波長650 nm有出入，可能與所掃描的樣品濃度有關(guān)，線性方程y＝0.2464x－0.01263，r＝0.9973，線性良好，范圍為0.05399～0.5399 mg/ml。

圖1　波長掃描

圖2　標準曲線

2.2方法的驗證結(jié)果

2.3.1重復性同一試樣6次乙醇殘留量相對標準偏差為2.45%（n＝6），測定結(jié)果見表1。

表1　重復性實驗

2.3.2穩(wěn)定性樣品溶液放置4℃，在0、4、8、12、16、20 h，進行樣品測定，乙醇殘留量相對標準偏差為2.79%，測定結(jié)果見表2。

表2　穩(wěn)定性實驗

2.3.3準確性結(jié)果表明，高、中、低3個濃度水平的回收率在99.22%～103.72%之間，平均回收率為101.26%±1.63%，RSD為1.61%，表明所采用的樣品處理方法及光譜條件均具有較好的可靠性，測定結(jié)果見表3。

表3　乙醇回收率試驗結(jié)果

2.4方法的初步應用測定結(jié)果顯示人血白蛋白乙醇殘留量要高于靜脈注射人免疫球蛋白（pH4）乙醇殘留量，這與靜脈注射人免疫球蛋白（pH4）層析工藝應該有關(guān)，10批次樣品的乙醇殘留量最高為編號2的人血白蛋白半成品（0.00797%），最低為編號1的靜脈注射人免疫球蛋白（pH4）成品（0.0055%），均遠遠低于藥典的半成品限量要求（0.025%），結(jié)果見表4。

3　討論

乙醇殘留量的定量測定大都采用氣相色譜法［8－11］，血液制品主要活性成分為蛋白類，由于蛋白質(zhì)的熱不穩(wěn)定性，氣相色譜法定量檢測含有蛋白水溶液制品的乙醇殘留量較為困難。對于血液制品中特別是半成品乙醇殘留量控制上，目前我國生物制品行業(yè)中均采用康衛(wèi)皿擴散法且為非定量檢測［7，12］，而對血液制品乙醇殘留定量沒有要求或少有文獻報道。本文改進的康衛(wèi)皿擴散法可準確的定量乙醇的殘留量，10批次樣品的乙醇殘留量最高為編號2的人血白蛋白半成品（0.00797%），均遠遠低于藥典的半成品限量要求（0.025%），且準確性試驗回收率101.26%±1.63%，RSD為1.61%定量準確；重復性及穩(wěn)定試驗RSD＜3%，試驗穩(wěn)定。

實驗證明，運用改進的康衛(wèi)氏皿擴散法定量測定血液制品中乙醇殘留量，重現(xiàn)性好，定量準確，易于操作，可用于血液制品中乙醇殘留量的檢測。

表4　樣品中乙醇殘留量的測定結(jié)果

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［2015－07－14收稿，2015－08－12修回］

［本文編輯：吳蓉］

［通訊作者］張曉杰，Email：251849753@qq.com

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.01.022

［中圖分類號］R917：R331

［文獻標志碼］A