閆　磊，李善昌，莊亞嚴(yán)，張鐵軍，趙　亮(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

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牽張力對大鼠髁突軟骨細(xì)胞炎性因子及Hedgehog相關(guān)基因的研究①

閆磊，李善昌，莊亞嚴(yán)，張鐵軍，趙亮(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

摘要:目的：研究牽張力對大鼠髁突軟骨細(xì)胞炎性因子及Hedgehog相關(guān)基因的影響。方法：體外培育大鼠髁突軟骨細(xì)胞，將P1代分為對照、低強(qiáng)度以及高強(qiáng)度3組，分別給予0%、3%以及15%的牽張力作用4h，對比三組軟骨細(xì)胞增殖情況、炎性因子及Hedgehog相關(guān)基因的變化。結(jié)果：培育48h后，對照組無明顯變化，高強(qiáng)度組A450值顯著下降，低強(qiáng)度組A450值顯著上升；給三組不同程度的牽張力后，三組間IL-1β與TNF-α相差較大，且由對照組到高強(qiáng)度組依次增大，高強(qiáng)度組IL-1β與TNF-α均顯著高于對照組與低強(qiáng)度組；低強(qiáng)度組的髁突軟骨細(xì)胞Hh表達(dá)水平均顯著高于其他兩組，而高強(qiáng)度組Smo的表達(dá)顯著低于對照組，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：Hedgehog基因參與了牽張力對軟骨細(xì)胞的調(diào)控過程，過度的牽張力會抑制軟骨細(xì)胞的增殖，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。適度的牽張力能夠刺激軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞:牽張力；鼠髁突軟骨細(xì)胞；炎性因子；相關(guān)性

顳下頜關(guān)節(jié)是人體頜面部唯一的左右雙側(cè)聯(lián)動關(guān)節(jié)，具有一定的穩(wěn)定性和多方向的活動性[1]。下頜在產(chǎn)生咀嚼、吞咽以及語言等功能時(shí)需要的生物力學(xué)負(fù)荷通常由髁突軟骨負(fù)擔(dān)。此外，下頜骨的生長方向及生長長度也會受到髁突軟骨的影響[2]。Hedgehog(Hh)是能夠編碼一系列分泌蛋白的分節(jié)極性基因。有研究報(bào)道表明[3]，Hh通路參與牽張力對軟骨細(xì)胞的調(diào)控過程的可能性十分大。但目前國內(nèi)對軟骨細(xì)胞調(diào)控相關(guān)研究較少。本文研究牽張力對大鼠髁突軟骨細(xì)胞炎性因子及Hedgehog相關(guān)基因的影響，以期發(fā)現(xiàn)牽引力對顳下頜關(guān)節(jié)的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)動物

Sprague-Dawley(SD)老鼠，雌雄不限，鼠齡為兩周。

1.2研究方法

1.2.1大鼠髁突軟骨的原代培養(yǎng)：在無菌條件下解剖分離大鼠雙側(cè)下頜髁突軟骨，剝離去除髁突表面的纖維組織后剪取髁突軟骨，將其剪碎成約1mm3。移入離心管，0.25%胰蛋白酶、37℃消化30min，0.2%膠原酶Ⅱ、37℃消化4h后，200目濾網(wǎng)過濾收集細(xì)胞，0.25%錐蟲藍(lán)染色，活細(xì)胞率大于90%則用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，胰酶消化，傳代培養(yǎng)，記為P1代細(xì)胞。

1.2.2大鼠髁突軟骨的鑒定：將P1代軟骨細(xì)胞接種于預(yù)先放好爬片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3d后光鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，4%多聚甲醛固定后，行甲苯胺藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞加力：取P1代軟骨細(xì)胞分為3組，接種于Flexcell加力板中，每組3個(gè)副孔。待細(xì)胞融合至80%時(shí)，更換為無FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使各組細(xì)胞狀態(tài)同步化后，再更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。按加力板使用說明，分別對3組細(xì)胞施加0.5Hz，0%(對照組)、3%(低強(qiáng)度組)和15%(高強(qiáng)度組)的牽張應(yīng)變，作用時(shí)間為4h。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測：加力結(jié)束后，每組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入10μL CCK-8溶液，孵育4 h，測定450 nm處的吸光度值(A450)，重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5Hedgehog相關(guān)基因及細(xì)胞炎性因子的檢測：提取RNA和反轉(zhuǎn)錄加力結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，兩步法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物中分別檢測細(xì)胞炎性因子IL-1β、TNF-α，Hedgehog信號通路分子Ihh、Ptc及Smo的基因表達(dá)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件分析。數(shù)據(jù)比較以χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)比較以t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析選用Spearman法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同程度的牽張力對髁突軟骨細(xì)胞增殖能力的影響

培育48h后，對照組無明顯變化，高強(qiáng)度組A450值顯著下降，低強(qiáng)度組A450值顯著上升，三組間差異較大，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1　不同程度的牽張力對髁突軟骨細(xì)胞

注：t為組內(nèi)完成細(xì)胞加力后與培育48h后對比，F(xiàn)值為三組間相互對比，*P<0.05。

2.2不同程度牽張力對髁突軟骨細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

給三組不同程度的牽張力后，三組間IL-1β與TNF-α相差較大，且由對照組到高強(qiáng)度組依次增大，高強(qiáng)度組IL-1β與TNF-α均顯著高于對照組與低強(qiáng)度組，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2不同程度牽張力對髁突軟骨細(xì)胞炎性

因子表達(dá)的影響

注：F值為三組間相互對比，*P<0.05。

2.3不同程度牽張力對髁突軟骨細(xì)胞Hedgehog通路基因表達(dá)的影響

給三組不同程度的牽張力后，低強(qiáng)度組的髁突軟骨細(xì)胞Hh表達(dá)水平均顯著高于其他兩組，而高強(qiáng)度組Smo的表達(dá)顯著低于對照組，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3　不同程度牽張力對髁突軟骨細(xì)胞Hedgehog

注：F值為三組間相互對比，*P<0.05。

3討論

有相關(guān)報(bào)道表明[4]，對軟骨細(xì)胞給予適合的力學(xué)刺激能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長、分化。但力學(xué)刺激程度如果較弱甚至沒有，或者過強(qiáng)，則會對軟骨細(xì)胞的生長代謝產(chǎn)生較大的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)含量平衡遭到破壞，引起關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性病變。Hedgehog基因是一種分節(jié)極性基因，參與了力學(xué)刺激對軟骨細(xì)胞的調(diào)控。

本文研究結(jié)果顯示，對三組髁突軟骨細(xì)胞進(jìn)行不同程度的牽張力后，各組A450值相差不大，但在培育48h后，對照組無明顯變化，而高強(qiáng)度組A450值顯著下降且遠(yuǎn)低于對照組，低強(qiáng)度組A450值顯著上升且遠(yuǎn)高于對照組。這提示在牽張力大小為3%作用4h后，軟骨細(xì)胞會在接下來的兩天內(nèi)大量增殖，而若牽引大小為15%則軟骨細(xì)胞的增殖會受到很大的抑制。給三組不同程度的牽張力后，三組間IL-1β與TNF-α相差較大，且由對照組到高強(qiáng)度組依次增大，給予15%牽張力的高強(qiáng)度組IL-1β與TNF-α均顯著高于對照組與低強(qiáng)度組。這表明高強(qiáng)度的力學(xué)刺激能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而低強(qiáng)度的效果不明顯。

俞云飛等[5]的研究中表示，牽張力能夠刺激下頜骨髁突增殖層軟骨細(xì)胞Hh家族基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖。這與本研究關(guān)于不同程度牽張力對髁突軟骨細(xì)胞Hedgehog通路基因表達(dá)影響的結(jié)果相同。給三組不同程度的牽張力后，低強(qiáng)度組的髁突軟骨細(xì)胞Hh表達(dá)水平均顯著高于其他兩組，而高強(qiáng)度組Smo的表達(dá)顯著低于對照組。這提示Hh基因家族對力學(xué)刺激十分敏感。Hh信號傳遞受靶細(xì)胞膜上兩種受體分別為Ptc和Smo的控制。受體Ptc有腫瘤抑制基因Patched編碼，是有12個(gè)跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成，能與配體直接結(jié)合，對Hh信號起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。綜上所述，Hedgehog基因參與了牽張力對軟骨細(xì)胞的調(diào)控過程，過度的牽張力會抑制軟骨細(xì)胞的增殖，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。而適度的牽張力能夠刺激軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃圣運(yùn)，李文剛，張世周，等.微血管吻合器在口腔頜面部缺損重建中的應(yīng)用[J].中華顯微外科雜志，2015,38(4)：389-391

[2]董瑞，王旭霞，張文娟，等.前牽引頦部反作用力對顳下頜關(guān)節(jié)影響的三維有限元分析[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2013,48(12)：740-744

[3]巫云霞，王林，張衛(wèi)兵，等.擴(kuò)張力作用下大鼠腭中縫組織成骨現(xiàn)象的連續(xù)觀察[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2010，26(3)：309-311

[4]白明海，吳漢江.牽張力與雌激素對兔鼻軟骨細(xì)胞增殖效應(yīng)調(diào)節(jié)的初步研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2009，25(4)：412-415

[5]俞云飛，徐宏光，宋俊興，等.力學(xué)刺激對軟骨細(xì)胞影響研究進(jìn)展[J].國際骨科學(xué)雜志，2012，33(5)：297-299

(收稿日期：2015-01-16)

中圖分類號：R782.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)01-0006-02

作者簡介：閆磊(1980～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。通訊作者：趙亮(1981～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。E-mail:28789079@qq.com

基金項(xiàng)目：①黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題，編號：2014-257。