任樹華，馮　玲，喻梅星，柳　怡，顏　焰，楊　凡

(1.成都市錦江區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，四川 成都　610021；

2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科，四川 成都　610041；

3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院-香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)聯(lián)合研究中心，四川 成都　610041)

?

異戊烯焦磷酸擴(kuò)增成人外周血以及臍帶血γδT細(xì)胞效能比較

任樹華1，馮玲2，喻梅星3，柳怡1，顏焰1，楊凡2

(1.成都市錦江區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，四川 成都610021；

2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科，四川 成都610041；

3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院-香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)聯(lián)合研究中心，四川 成都610041)

[摘要]目的：研究異戊烯焦磷酸(IPP)擴(kuò)增成人外周血以及臍帶血γδT細(xì)胞效能比較。方法：梯度離心法分離成人外周血以及臍帶血淋巴細(xì)胞，分別加入IL-2和IPP，在10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)體系下，刺激培養(yǎng)不同時(shí)間，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2種標(biāo)本被刺激后γδT細(xì)胞增殖比例。結(jié)果：IL-2加IPP擴(kuò)增后成人外周血γδT細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中比例上升為73.05%±2.92%；臍帶血組擴(kuò)增后γδT細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中比例上升為38.66%±5.14%；不同來(lái)源的γδT細(xì)胞的在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間刺激下擴(kuò)增的效率有顯著性差異。相同的擴(kuò)增條件下，成人γδT細(xì)胞增殖峰值在第14天，而足月兒的擴(kuò)增峰值延遲到第18天。結(jié)論：臍帶血來(lái)源的γδT細(xì)胞對(duì)IPP抗原刺激反應(yīng)較弱，可能是新生兒早期天然免疫力低下的原因之一。

[關(guān)鍵詞]γδT細(xì)胞；異戊烯焦磷酸；新生兒；臍帶；血液

近年來(lái)報(bào)道，感染是新生兒致死的主要原因之一，而低下的免疫功能是新生兒易患高致死性感染性疾病的主要原因[1]。對(duì)于新生兒而言，其抗原提成細(xì)胞(DC細(xì)胞等)的不成熟以及孕期Th1主導(dǎo)的免疫環(huán)境一直延續(xù)到出生后數(shù)月將會(huì)抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答[2]。因此天然免疫功能對(duì)于新生兒至關(guān)重要。

γδT細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型天然免疫細(xì)胞，它不同于傳統(tǒng)的αβT細(xì)胞，而是擁有γδ鏈的天然免疫細(xì)胞。γδT細(xì)胞不僅有高效的抗病毒和吞噬等典型的天然免疫功能，同時(shí)還可以作為特殊APC細(xì)胞進(jìn)一步活化適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3]。雖然γδT細(xì)胞有強(qiáng)大的橫跨天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能，但是γδ在成人外周血中的數(shù)量?jī)H有2%～12%，而在臍帶血中的比例更少。數(shù)量少成為制約其發(fā)揮功能的主要問題。如何在急性感染侵襲時(shí)產(chǎn)生大量的γδT細(xì)胞發(fā)揮免疫作用已經(jīng)成為亟需解決的問題。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)IPP抗原能與γδ細(xì)胞的TCR受體結(jié)合從而刺激γδT細(xì)胞的大量增殖，但是對(duì)于臍帶血來(lái)源的γδ細(xì)胞目前研究甚少。本試驗(yàn)致力于比較IPP對(duì)于成人外周血和臍帶血來(lái)源的γδT細(xì)胞的擴(kuò)增效能，從而提供IPP用于高效擴(kuò)增臍帶血γδT 細(xì)胞臨床應(yīng)用的初期試驗(yàn)依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1標(biāo)本的采集和PBMC的制備2011—2012年來(lái)自成都血液中心新鮮成人外周血4例，每例400 mL，經(jīng)過分離處理后得到血液白膜層15 mL。白膜層加入PBS稀釋，經(jīng)過Ficoll-Hypaque分離白膜層，400 G，10 min梯度離心得到PBMC8×107細(xì)胞/例。2012年來(lái)自錦江區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科正常新鮮足月兒臍帶血4例，每例100 mL，處理同前。

1.2IPP刺激作用使用10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入9 μg/mL的IPP。同時(shí)從培養(yǎng)第3天開始每隔3 d加入IL-2使之最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為500 U/mL。分配PBMCs在24孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×106個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)箱中。

1.3流式測(cè)定細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)第0 天，和第6～20天，每隔2～4 d收集1孔。PBMCs表面染色anti- human CD3(PB-BD)，anti-human TCR Vδ2 (PE-BD)。使用Gallios (Beckman Coulter) 流式細(xì)胞儀器測(cè)定，并用FlowJo (version 7.6.5，Tree Star)流式分析軟件分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)于臍帶血γδT細(xì)胞和成人外周血γδT細(xì)胞擴(kuò)增的組間比較使用t檢驗(yàn)，對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)擴(kuò)增倍率比較采用重復(fù)測(cè)量的t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1γδT 細(xì)胞擴(kuò)增比率的測(cè)定結(jié)果詳見表1。

經(jīng)過IPP加IL-2的擴(kuò)增后，選取最高擴(kuò)增比率得到結(jié)論：成人組為73.05%±2.92%，臍帶血組為38.66%±5.14%，二者比較有顯著性差異(P<0.05)。

表1　擴(kuò)增率比較

2.2γδT 細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖倍數(shù)測(cè)定IPP加IL-2擴(kuò)增γδT 細(xì)胞后，從第6天開始到第20天，每2～4 d檢測(cè)增殖倍數(shù)。臍帶血來(lái)源的γδT 細(xì)胞增殖倍數(shù)的高峰在第18天，而成人外周血來(lái)源的γδT 細(xì)胞增殖倍數(shù)高峰在第14天

3討論

圍生期的死亡因素中，嚴(yán)重的感染一直居高不下。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于新生兒適應(yīng)性免疫應(yīng)答和抗原提成細(xì)胞的成熟度，少有關(guān)于天然免疫反應(yīng)能力的報(bào)道。新生兒時(shí)期免疫系統(tǒng)并未完全發(fā)育成熟，其功能與兒童及成人有較大差別。在生后初期，由于T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能較多依賴于時(shí)間和抗原的刺激，因此適應(yīng)性免疫應(yīng)答在圍生期的發(fā)揮抗感染能力非常有限[4]。因此天然免疫在新生兒生后早期有至關(guān)重要的作用。

γδT細(xì)胞作為新近研究的天然免疫細(xì)胞，主要分布于外周血和淋巴器官中，主要的人類的γδT細(xì)胞以Vγ9Vδ2T細(xì)胞為主。Vγ9Vδ2T細(xì)胞是不受MHC分子限制作用的，通過isoprenoid biosynthesis 通路代謝。IPP可以通過macalonate 通路選擇性地活化γδT細(xì)胞。

但是國(guó)內(nèi)外針對(duì)外周血的研究報(bào)道，γδT細(xì)胞在外周血PBMC中的比例2%～12%不等，我們選取的正常成人所測(cè)的比例在2.35%～6.84%之間，符合目前文獻(xiàn)報(bào)道。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臍帶血中的γδT細(xì)胞在1.25%～2.15%之間，與之前的報(bào)道類似。如何有效地提高γδT細(xì)胞數(shù)目，目前國(guó)內(nèi)外主要有IPP方法擴(kuò)增，但是尚無(wú)人比較2種人類主要來(lái)源的γδT細(xì)胞的增殖效果以及增殖反應(yīng)的最佳時(shí)間。我們的結(jié)果提示，以IL-2作為淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的維持因子，有一定的輔助增殖作用；沒有IL2的擴(kuò)增條件下，即使有高效的刺激因子，γδT細(xì)胞擴(kuò)增仍然不明顯。進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)，擴(kuò)增刺激劑在IL-2的輔助作用下，在不同的來(lái)源γδT細(xì)胞體系中有不同的擴(kuò)增效率，成人γδT細(xì)胞對(duì)于IPP抗原刺激的反應(yīng)明顯高于臍帶血來(lái)源的γδT細(xì)胞。

時(shí)間梯度擴(kuò)增試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于成人γδT細(xì)胞第14天的擴(kuò)增時(shí)間最佳，但是對(duì)于臍帶血γδT細(xì)胞而言第18天的擴(kuò)增效果最佳。試驗(yàn)推測(cè)，因?yàn)镮PP是直接作用的macalonate通路選擇性的活化γδT細(xì)胞，而臍帶血的γδT細(xì)胞的TCR受體的發(fā)育并不完善，并且數(shù)量較少，因此即使相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的IPP依然無(wú)法高效地引起增殖反應(yīng)。

無(wú)論是臍帶血來(lái)源的γδT細(xì)胞還是成人外周血γδT細(xì)胞，在IPP加IL-2的輔助下經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)刺激時(shí)候之后，均能有效地進(jìn)行擴(kuò)增，但是臍帶血的擴(kuò)增效能較低。我們的試驗(yàn)結(jié)論為新生兒在遭遇急性感染時(shí)候，早期及時(shí)地?cái)U(kuò)增γδT細(xì)胞，提供高效的天然免疫能力， 及時(shí)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答提供新的方法思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]何振娟，陳同辛，吳圣楣，等．PMA和IM誘導(dǎo)的新生兒臍帶血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[J]．新生兒科雜志，2000，15(4)：152-154, 191-192．

[2]郝麗，鄭成中．新生兒感染T淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子變化分析[J]．臨床兒科雜志，2014，32(9)：825-828．

[3]胡朝英，錢柳，程偉志，等．γδ T細(xì)胞誘導(dǎo)與分化的初步研究-Ⅰ[J]．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2010，26(4)：368-371．

[4]劉敬．臍血免疫功能研究進(jìn)展[J]．中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2001(4)：65-66．

(收稿日期：2015-10-21)

[中圖分類號(hào)]R722

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2016.02.016

通信作者：任樹華，2359751116@qq.com

優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20151228.1653.016.html