侯雪芹，李悅，榮翠平，黃莉，邱建利，

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安　271016； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州　510405； 3. 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林　541004)

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研究報(bào)告

雌性大鼠去卵巢模型中腦神經(jīng)內(nèi)分泌信號異常傳導(dǎo)的機(jī)理

侯雪芹1*，李悅2，榮翠平3，黃莉2，邱建利2，

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安271016； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州510405； 3. 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林541004)

【摘要】目的比較正常大鼠和去卵巢大鼠腦內(nèi)主要神經(jīng)信息分子的種類和含量，以觀察生理和病理狀態(tài)下，神經(jīng)內(nèi)分泌信號傳導(dǎo)通路的異同，初步探討卵巢(雌激素)對神經(jīng)內(nèi)分泌信號傳導(dǎo)機(jī)制。方法觀察大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞病理形態(tài)，運(yùn)用高效液相色譜-熒光檢測器定量檢測不同腦區(qū)及血清中腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)及高香草酸(HVA)的含量變化。結(jié)果腦組織HE染色顯示OVX組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元退化比假手術(shù)組明顯。與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠的NE、E含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的區(qū)域分別為海馬和血清；HVA在丘腦中含量比假手術(shù)組升高；DA含量在皮質(zhì)區(qū)比假手術(shù)組下降。與假手術(shù)組比較，OVX組在海馬和小腦區(qū)5-HT含量上升，而5-HIAA含量下降；在皮質(zhì)、丘腦和血清中，OVX組5-HT含量較假手術(shù)組下降，而5-HIAA含量升高。結(jié)論去卵巢大鼠的雌激素水平低下狀態(tài)可能引起腦組織攜帶的主要信息分子(經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸類遞質(zhì))釋放或合成發(fā)生異常，因此去卵巢模型大鼠可以作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌信號異常的載體，為圍絕經(jīng)期綜合征的信號傳導(dǎo)的研究提供了一種新的思路和方法。

【關(guān)鍵詞】去卵巢大鼠模型；神經(jīng)遞質(zhì)；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；高效液相色譜-熒光檢測器

雌性大鼠去卵巢模型(ovariectomized，OVX)是基于圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后婦女因雌激素水平下降而建立的動物模型[1]，其特點(diǎn)是簡單易行，不需要特殊設(shè)備，既可預(yù)防給藥，亦可治療給藥，又可廣泛應(yīng)用于藥理、藥效學(xué)的研究。由于雌激素功能廣泛，其缺乏可導(dǎo)致其他系統(tǒng)的改變，作用不是單一且穩(wěn)定[2]。因此OVX模型為目前多研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的模型之一。雌激素不僅具有調(diào)整和控制生殖和生長系統(tǒng)的作用，還在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)等方面[3]，但其具體作用機(jī)制迄今尚不清楚。近來出現(xiàn)了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常與雌激素密切相關(guān)的新理論，提示去卵巢模型大鼠可以作為腦神經(jīng)內(nèi)分泌信號異常新模型。為了進(jìn)一步研究去卵巢引起的雌激素分泌不足導(dǎo)致腦內(nèi)與生殖相關(guān)的神經(jīng)回路紊亂的作用機(jī)制，我們設(shè)計(jì)了本文的實(shí)驗(yàn)。同時也為探討雌激素與抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究者提參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

2月齡雌性SD大鼠24只，SPF級，體重180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供【SCXK(粵)2008-0002】。飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)三元里校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房【SYXK( 粵) 2013-0085】。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H13020655，批號J3048403)，規(guī)格：160萬單位/瓶。左旋多巴(L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)、多巴胺(dopamine，DA)、5-羥色胺(serotonin hydrochloride，5- HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid，5- HIAA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)標(biāo)準(zhǔn)品(純度均高于99%，美國Sigma公司)；檸檬酸、乙酸鈉、1-庚烷磺酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、三乙胺、L-半胱氨酸、高氯酸均為分析純；甲醇為色譜純，水為二次去離子水。

超低溫冰箱：Forma Scientific；高速離心機(jī)：貝克曼Microfuge Lite；脫水機(jī)：Leica TP1020；包埋機(jī)：LEICA EG1160；切片機(jī)：Leica RM2135；圖像采集設(shè)備：Leica DM4000B顯微鏡；色譜儀和熒光檢測器：Waters 2695，Waters 2475 Multi λ fluorescence detector；反相色譜柱Nova-pak C18(150×4.6 mm，粒徑5 μm)。

1.3方法

1.3.1大鼠卵巢切除模型建立

2月齡雌性SD大鼠24只，正常飼養(yǎng)1個月后，體重分層后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組(OVX組)，每組各12只動物。手術(shù)操作步驟：禁食12 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉后，無菌條件下采用背側(cè)雙切口暴露雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織，模型組切除雙側(cè)卵巢；術(shù)后 3 d予注射用青霉素鈉肌肉注射，4萬U/天，預(yù)防切口感染。造模后3個月取材進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.3.2腦組織形態(tài)學(xué)觀察

大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉后，開胸心臟灌流，斷頭取腦組織，10%甲醛固定24 h。組織修塊后，按常規(guī)方法脫水、浸蠟、石蠟包埋及切片，最后行HE染色。

1.3.3腦組織和血清神經(jīng)遞質(zhì)檢測

(1)腦組織和血清取材

腹腔麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈采血后迅速將大鼠斷頭，取新鮮腦組織，在冰上分離腦組織的海馬、皮質(zhì)、丘腦和小腦，立即置于-80℃保存?zhèn)溆茫谎簶悠酚?℃靜置30 min后，4℃，3000 r/min離心30 min，留取血清備用。其中腦區(qū)取材參照大腦立體定位圖譜第三版。

(2)標(biāo)準(zhǔn)品配制

精確稱取神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于10 mL容量瓶中，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶劑振搖使其溶解并定容，分別制成質(zhì)量濃度為0.1 mg /mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于4℃冰箱中保存，使用時用標(biāo)準(zhǔn)品溶劑逐級稀釋至所需濃度[4]。

(3)樣品處理

樣品處理參考趙燕燕等[4]的方法。

(4)色譜條件

Waters 2475 Multi λ fluorescence detector，反相色譜柱Nova-pak C18(150×4.6 mm，粒徑5 μm)，流動相為檸檬酸-乙酸鈉緩沖液(50 mmol/L檸檬酸、50 mmol/L乙酸鈉 0.5 mmol/L 1-庚烷磺酸鈉、5 mmol/L三乙胺、0.5 mmol/L Na2EDTA)-甲醇(95∶5，v/v)(pH 3.8)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；發(fā)射波長330 nm，激發(fā)波長280 nm[5]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2結(jié)果

2.1腦組織病理形態(tài)的比較

腦組織經(jīng)HE染色后呈現(xiàn)的病理形態(tài)如圖1所示，大鼠海馬HE染色表明，假手術(shù)組的大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)椎體細(xì)胞均排列整齊，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)都完整，形態(tài)正常；OVX組的大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列凌亂，細(xì)胞的體積縮小，細(xì)胞核固縮，胞漿濃縮，出現(xiàn)形態(tài)異常。OVX組的大鼠皮質(zhì)和丘腦區(qū)具有明顯地神經(jīng)元凋亡跡象，出現(xiàn)大量的神經(jīng)元壞死(紅色神經(jīng)元)，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮，溶解，消失；組織變得結(jié)構(gòu)疏松，呈現(xiàn)空隙狀或形成空腔，其中不乏有泡沫細(xì)胞浸潤。而假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)較致密，細(xì)胞空隙較少，其結(jié)果表明去卵巢能夠加速雌性大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元衰老。

2.2腦組織及血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：OVX組大鼠的NE、E含量比假手術(shù)組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的區(qū)域分別為海馬和血清；NE、E的代謝產(chǎn)物HVA僅在丘腦中檢出，且其含量比假手術(shù)組升高。DA主要在皮質(zhì)檢出，OVX組DA含量比假手術(shù)組下降。5-HT與其代謝產(chǎn)物5-HIAA呈現(xiàn)相反的變化趨勢；在海馬和小腦區(qū)，與假手術(shù)組比較，OVX組5-HT含量上升，而5-HIAA含量下降；在皮質(zhì)、丘腦和血清中，OVX組5-HT含量較假手術(shù)組下降，而5-HIAA含量升高(見表1)。

圖1　假手術(shù)和去卵巢大鼠腦組織病理形態(tài)對照圖Fig.1　Histopathological observation of the brain tissues of ovariectomized and sham-operated rats.

2.3線性關(guān)系

分別精密吸取濃度為2、4、10、20、40、80、160、400、800 ng/mL的NE、E、DA、5-HT、5-HIAA和HVA系列對照品溶液各20 μL，注入色譜儀并記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，計(jì)算出NE和E線性回歸方程、相關(guān)系數(shù), 結(jié)果見表2。

表1　去卵巢大鼠不同腦區(qū)及血清內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量±s, n=7)

表2　6種神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍

2.4色譜分離和保留時間

圖2　7種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2　Chromatograms of the standard mixed solution of 7 monoamine neurotransmitters

標(biāo)準(zhǔn)液和樣品中的神經(jīng)遞質(zhì)(NE、E、DA、5-HT、DOPAC、5-HIAA、HAV)的峰之間分離較好，保留時間分別在9.830、11.154、15.280、16.98、23.276、26.046 min和34.211 min左右，腦組織勻漿和血清中雜質(zhì)峰對結(jié)果無干擾，色譜圖見圖2和圖3。

3討論

大量的研究表明，雌性大鼠卵巢切除造成的模型能夠正確模擬女性雌激素低落引起的綜合疾病特征，是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[6]、老年癡呆癥[7]、抑郁癥[8]、婦科相關(guān)疾病等的優(yōu)秀模型。將3月齡或6月齡雌性大鼠卵巢切除后3個月，可檢測到OVX大鼠血清中雌二醇水平可下降約22%[9]甚至89%[10]，提示去卵巢大鼠模型能較好的模擬雌激素水平下降。本文以卵巢功能的退行性改變?yōu)橹行沫h(huán)節(jié)，研究雌激素不足時腦內(nèi)與生殖相關(guān)的神經(jīng)回路的變化[11]，揭示女性生殖內(nèi)分泌功能失調(diào)時，腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)死亡，直接或間接地影響攜帶的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的信息傳導(dǎo)至下丘腦，可導(dǎo)致GnRH細(xì)胞上轉(zhuǎn)導(dǎo)異常內(nèi)分泌信號[12]，使其與認(rèn)知功能相關(guān)的神經(jīng)回路中斷，加速腦部衰老的進(jìn)程。參與神經(jīng)內(nèi)分泌信號傳導(dǎo)的物質(zhì)包括單胺氧化酶、神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)。神經(jīng)遞質(zhì)包括去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)和高香草酸(HVA)等，是調(diào)節(jié)神經(jīng)中樞生理活動的重要物質(zhì)。測定腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的含量，可為多種疾病的診斷和治療以及精神疾病的機(jī)制研究提供依據(jù)。

NE、E參與學(xué)習(xí)記憶、覺醒和睡眠、精神活動、心腦血管活動等的調(diào)節(jié)，與人類的行為有密切關(guān)系，是參與老年性癡呆發(fā)病的重要神經(jīng)遞質(zhì)。DA除了具有運(yùn)動控制功能外，還參與調(diào)節(jié)情感思維、神經(jīng)內(nèi)分泌等，DA功能的失活將導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)病[13]；5-HT在人類情緒、認(rèn)知等方面也起著重要作用。肖愛嬌等[14]研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥模型大鼠血清雌二醇水平下降、海馬5-HT及5-HIAA含量減少，不僅支持了抑郁癥發(fā)病的5-HT功能降低假說，還提示雌激素水平與海馬5-HT之間可能存在作用鏈。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠海馬中NE及5-HT代謝產(chǎn)物5-HIAA均明顯下降，提示該去卵巢大鼠中樞NE和5-HT功能下降，可作為老年性癡呆或抑郁癥模型進(jìn)行藥物篩選研究。單胺氧化酶是催化5-HT生成5-HIAA的關(guān)鍵酶，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外周血清5-HIAA明顯升高，與中樞5-HIAA變化相反，可能與單胺氧化酶在中樞和外周的活性程度不同有關(guān)。

通過比較正常大鼠和去卵巢大鼠腦內(nèi)主要神經(jīng)信息分子的種類和含量，結(jié)果與范紅霞等[15]報(bào)道的較一致，提示該模型可作為以卵巢功能的退行性改變?yōu)橹行牡母昶诰C合征模型，進(jìn)而研究該病產(chǎn)生的一系列綜合癥候群。因神經(jīng)功能紊亂是更年期綜合征的主要表現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)的變化能夠更好的成為探討更年期綜合征發(fā)病的機(jī)理。

OVX模型病理切片的研究表明海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，錐體細(xì)胞排列凌亂，丘腦區(qū)有明顯地神經(jīng)元凋亡跡象，出現(xiàn)大量的神經(jīng)元壞死。該區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少，相應(yīng)受體的敏感性改變，遞質(zhì)系統(tǒng)間失衡。神經(jīng)內(nèi)分泌不足會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的退化性疾病，能夠較好的模擬如老年性癡呆等具有女性發(fā)病傾向的疾病。同時，由于該模型具有簡單易行的特點(diǎn)，既可預(yù)防給藥，也可治療給藥，尤其適合復(fù)方多靶點(diǎn)的新藥研發(fā)。

圖3　大鼠腦組織勻漿及血清樣品色譜圖注：A.假手術(shù)組，B.OVX組Fig.3　Chromatograms of the rat brain homogenate and serum samples. A. Sham-operated group; B: Ovariectomized group.

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科技工作者科學(xué)道德規(guī)范(三)

學(xué)術(shù)道德規(guī)范

第五條 進(jìn)行學(xué)術(shù)研究應(yīng)檢索相關(guān)文獻(xiàn)或了解相關(guān)研究成果，在發(fā)表論文或以其他形式報(bào)告科研成果中引用他人論點(diǎn)時必須尊重知識產(chǎn)權(quán)，如實(shí)標(biāo)出。

第六條 尊重研究對象(包括人類和非人類研究對象)。在涉及人體的研究中，必須保護(hù)受試人合法權(quán)益和個人隱私并保障知情同意權(quán)。

第七條 在課題申報(bào)、項(xiàng)目設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)資料的采集與分析、公布科研成果，確認(rèn)科研工作參與人員的貢獻(xiàn)等方面，遵守誠實(shí)客觀原則。對已發(fā)表研究成果中出現(xiàn)的錯誤和失誤，應(yīng)以適當(dāng)?shù)姆绞接枰怨_和承認(rèn)。

第八條 誠實(shí)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)嘏c他人合作。耐心誠懇地對待學(xué)術(shù)批評和質(zhì)疑。

第九條 公開研究成果、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)等，必須實(shí)事求是、完整準(zhǔn)確。

第十條 搜集、發(fā)表數(shù)據(jù)要確保有效性和準(zhǔn)確性，保證實(shí)驗(yàn)記錄和數(shù)據(jù)的完整、真實(shí)和安全，以備考查。

第十一條 對研究成果做出實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)的專業(yè)人員擁有著作權(quán)。僅對研究項(xiàng)目進(jìn)行過一般性管理或輔助工作者，不享有著作權(quán)。

第十二條 合作完成成果，應(yīng)按照對研究成果的貢獻(xiàn)大小的順序署名(有署名慣例或約定的除外)。署名人應(yīng)對本人作出貢獻(xiàn)的部分負(fù)責(zé)，發(fā)表前應(yīng)由本人審閱并署名。

第十三條 科研新成果在學(xué)術(shù)期刊或?qū)W術(shù)會議上發(fā)表前(有合同限制的除外)，不應(yīng)先向媒體或公眾發(fā)布。

第十四條 不得利用科研活動謀取不正當(dāng)利益。正確對待科研活動中存在的直接、間接或潛在的利益關(guān)系。

第十五條 科技工作者有義務(wù)負(fù)責(zé)任地普及科學(xué)技術(shù)知識，傳播科學(xué)思想、科學(xué)方法。反對捏造與事實(shí)不符的科技事件，及對科技事件進(jìn)行新聞炒作。

第十六條 抵制一切違反科學(xué)道德的研究活動。如發(fā)現(xiàn)該工作存在弊端或危害，應(yīng)自覺暫緩或調(diào)整、甚至終止，并向該研究的主管部門通告。

第十七條 在研究生和青年研究人員的培養(yǎng)中，應(yīng)傳授科學(xué)道德準(zhǔn)則和行為規(guī)范。選拔學(xué)術(shù)帶頭人和有關(guān)科技人才，應(yīng)將科學(xué)道德與學(xué)風(fēng)作為重要依據(jù)之一。

Mechanism of abnormal transduction of neuroendocrine signals in the brain of ovariectomized rat

HOU Xue-qin1*, LI Yue2, RONG Cui-ping3, HUANG Li2, QIU Jian-li2

(1. Taishan Medical University, Tai’an, Shandong 271016; 2. the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405. 3. Guilin Medical College, Guilin 541004)

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of ovariectomy on signal transduction of neuroendocrine signals in the rat brain. Methods Twenty-four healthy SPF 2-month-old female Sprague-Dawley rats were randomly divided into ovariectomized group and sham-operated group (n=12). Morphological changes of the brain neurons were examined by pathology using HE staining. The content of epinephrine (E), norepinephrine (NE), dopamine (DA), 5-hydroxytryptamine (5-HT), 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA) and homovanillic acid (HVA) in plasma and different brain regions were detected by high performance liquid chromatography (HPLC). ResultsPathological examination showed obvious neuron degeneration in the brain of OVX rats. Compared with the sham-operated group, contents of NE and E in the OVX group were lower, especially in the hippocampus and serum. In the OVX rats, HVA level in the thalamus was higher than that in the sham-operated group, while DA content in the cortex was lower. 5-HT was higher in the hippocampus and cerebellum of OVX group when compared with the sham-operated group, and a lower level was observed in the cortex, thalamus and serum. Moreover, the changes of 5-HIAA was in contrary to that of 5-HT. Conclusions Declined secretion of estrogen after ovariectomy induces abnormal synthesis and secretion of main signal molecules (classic neurotransmitters and amino acids) in the brain tissue. Thus, being a model with abnormal neuroendocrine signaling, the OVX rat provides new ideas and methods for research of signal transduction in peri-menopausal syndrome.

【Key words】Ovariectomy; Neurotransmitter; Signal transduction; Pathology; High performance liquid chromatography; Peri-menopausal syndrome; Rat

[收稿日期]2015-11-04

Corresponding author:HOU Xue-qin, E-mail: houxueqin09@163.com

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.014

【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847(2016) 01-0080-07

[通訊作者]侯雪芹(1985-)，女，博士，講師，研究方向：腦病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究.E-mail： houxueqin09@163.com

[基金項(xiàng)目]高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20114425110001)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃基金(J14LM03)。