顧洪偉，陳琦，張煒，李玉桑，唐和斌

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)研究室，武漢　430074)

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研究報(bào)告

小鼠原發(fā)性肝癌建模方法的優(yōu)化

顧洪偉，陳琦，張煒，李玉桑*，唐和斌

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)研究室，武漢430074)

【摘要】目的建立良好、快捷、穩(wěn)定的小鼠原發(fā)性肝癌模型。方法將128只雄性KM小鼠隨機(jī)均分為8組：正常組給予自由飲食；二乙基亞硝胺(DEN)水溶液組每天給予含DEN(16.5 mg/kg)的水溶液；高劑量DEN麻油組(7次/周、3次/周、1次/周)，經(jīng)口給予含DEN(16.5 mg/kg)的麻油溶液；而低劑量DEN麻油組、nano-DEN組、納米載體組則分別每周經(jīng)口給予含DEN(8.25 mg/kg)的麻油溶液和nano-DEN或同量的納米載體。20周后，處死小鼠，取肝臟標(biāo)本，固定后行HE染色。結(jié)果(1)含DEN的各組小鼠均出現(xiàn)不同程度毛色枯燥、無(wú)光澤、行動(dòng)遲緩、體重增長(zhǎng)緩慢；(2)20周時(shí)，同DEN水溶液組，高劑量DEN麻油組小鼠均出現(xiàn)腫瘤，且其1次/周的小鼠死亡率較低；(3)Nano-DEN組小鼠無(wú)死亡，且其肝臟損傷的HE評(píng)分較低劑量DEN麻油組嚴(yán)重。結(jié)論DEN溶于麻油的經(jīng)口給藥增加了小鼠服藥的順應(yīng)性，長(zhǎng)期低頻率給藥能大大降低造模過(guò)程中的死亡率。而DEN的納米微乳制劑，能增強(qiáng)對(duì)肝臟的損傷程度。

【關(guān)鍵詞】二乙基亞硝胺；原發(fā)性肝癌；納米二乙基亞硝胺

原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國(guó)其發(fā)病率和死亡率均為世界首位，是嚴(yán)重危害健康的重大疾病[1]。遺憾的是其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)明確其發(fā)病機(jī)理來(lái)尋找防治肝癌的有效手段，是改善人類(lèi)健康的重大科學(xué)問(wèn)題之一[2]。

要研究肝癌的發(fā)生機(jī)制，首先要建立與人類(lèi)肝癌自然發(fā)生過(guò)程相似的動(dòng)物模型。常見(jiàn)的肝癌動(dòng)物模型有：自發(fā)性肝癌模型、移植型肝癌模型、轉(zhuǎn)基因肝癌模型、化學(xué)誘發(fā)性肝癌模型。自發(fā)性肝癌由于發(fā)生情況不均，很難在短時(shí)間內(nèi)獲得大量類(lèi)似的腫瘤學(xué)材料，且觀(guān)察時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)較大，故在實(shí)際科研工作中較少使用。移植性肝癌模型操作繁雜，成功率依賴(lài)于技術(shù)的成熟性，因此較難獲得；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型制作技術(shù)要求極高，價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)開(kāi)展的研究尚較少；化學(xué)誘發(fā)性肝癌模型操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低，且能較好的模擬人類(lèi)肝癌的自然病理過(guò)程，制作方法簡(jiǎn)單，是最常用的建模方法之一[3]?；瘜W(xué)誘發(fā)型肝癌模型最經(jīng)典方法的是將二乙基亞硝胺(DEN)溶于水中，給予小鼠自由飲用[4]。本實(shí)驗(yàn)改變了給藥方式，即將DEN溶于麻油中經(jīng)口給藥，并探討了不同給藥頻率對(duì)小鼠死亡率的影響。

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料因其具有靶向定位、緩釋控釋藥物、載藥量高、提高藥物吸收率等優(yōu)點(diǎn)而在藥物傳輸、癌癥治療、基因治療等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5-8]。但是利用其負(fù)面生物效應(yīng)，在造模領(lǐng)域的應(yīng)用卻未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)期望通過(guò)DEN納米化，以達(dá)到緩釋及增強(qiáng)對(duì)肝臟損傷的作用，從而在短時(shí)間內(nèi)建立原發(fā)性肝癌的動(dòng)物模型。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性KM小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK(鄂)2008-0005]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作均獲中南民族大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批許可后[2012-SCUEC-AEC-002]，在中南民族大學(xué)藥學(xué)院SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行[SYXK(鄂)2014-0078]。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。對(duì)小鼠的處理符合2006年中國(guó)科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[9]。

1.2試劑與儀器

二乙基亞硝胺(DEN，淡黃色液體，密度為0.94 g/mL)購(gòu)自“梯希愛(ài)”上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；麻油購(gòu)自武漢福達(dá)食用油調(diào)料有限公司；蘇木精購(gòu)自南京建成科技有限公司；伊紅購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；多聚甲醛、無(wú)水乙醇、二甲苯購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。TP1020脫水機(jī)(德國(guó)Leica公司)；EG0050H石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)；RM2265切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；ALC-210.3型電子分析天平(德國(guó)Acculab公司)；Nikon 50i顯微成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1誘癌劑配制

取347.5 μL(即330 mg)的DEN原液，加至5000 mL無(wú)菌蒸餾水中，即66 μg/mL的DEN水溶液為DEN水溶組小鼠的飲用水；取0.5 mL(即470 mg)的DEN原液加至10.9 mL麻油中，即41.25 mg/mL的DEN麻油溶液做高劑量DEN麻油組小鼠的誘癌劑；取0.25 mL(即235 mg)的DEN原液加至11.1 mL麻油中，即20.625 mg/mL的DEN麻油溶液做低劑量DEN麻油組小鼠的誘癌劑；Nano-DEN及納米載體由華中科技大學(xué)納米中心趙小靜博士制備(將4%的DEN溶于15.6%的麻油中，再加入1.2%蛋黃卵磷脂，溶解混勻，制成油相；將1% Tween 80和2.25%甘油加入75.55%的水中，制成水相；60℃條件下，油相滴入水相中，攪拌15 min；然后10 000 r/min高剪切2 min；最后100 Mpa高壓均質(zhì)5次即得到nano-DEN。納米載體油相為1.2%蛋黃卵磷脂溶于20%的麻油中，其余步驟與nano-DEN的制備相同)，nano-DEN終濃度為含20.625 mg/mL DEN。

1.3.2分組與DEN及nano-DEN誘導(dǎo)肝癌

將128只KM小鼠預(yù)飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境一周后分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)取16只作為正常組，常規(guī)自由飲水。其余小鼠隨機(jī)均分為7組，每組16只小鼠：二乙基亞硝胺(DEN)水溶組每天按體重給予16.5 mg/kg(即2.5 mL/10 g)的DEN水溶液，且每天以普通過(guò)濾水補(bǔ)充不足；經(jīng)口高劑量組(7次/周、3次/周、1次/周)每周按體重經(jīng)口給予16.5 mg/kg(即4 μL/10g)的DEN麻油溶液；而經(jīng)口低劑量組(1次/周)、納米載體組(1次/周)、nano-DEN組(1次/周)則分別每周按體重經(jīng)口給予8.25 mg/kg(即4 μL/10g)的DEN麻油溶液、納米載體、nano-DEN。連續(xù)造模20周后，各組剩余小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，深度麻醉后快速脫臼處死，打開(kāi)腹腔，取肝臟、肺和腎臟，取部分肝臟組織保存于-80℃冰箱中用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3小鼠行為學(xué)及肝臟大體觀(guān)

每天觀(guān)察小鼠精神狀態(tài)，飲食狀況，被毛變化，并每周稱(chēng)重，記錄每組小鼠死亡數(shù)；造模20周后，觀(guān)察各組剩余小鼠肝臟的形態(tài)、顏色、質(zhì)地和肉眼可見(jiàn)的肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)；計(jì)算小鼠存活率，存活率=每組存活的小鼠數(shù)/各組小鼠總數(shù) × 100%。

1.3.4病理觀(guān)察

切取所有實(shí)驗(yàn)組小鼠(包括前期死亡)的肝臟右葉，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)制成4 μm連續(xù)石蠟切片；同步烤片，然后脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片；光鏡下胞質(zhì)染為紅色，細(xì)胞核染為藍(lán)色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組小鼠行為學(xué)及體重變化

正常組及納米載體組小鼠活潑好動(dòng)、反應(yīng)靈活、皮毛光澤，其余各組小鼠均出現(xiàn)不同程度毛色枯燥、發(fā)黃、無(wú)光澤、行動(dòng)遲緩。且隨著給藥頻率和給藥劑量的增加，小鼠癥狀加重。與正常組相比，納米載體組、低劑量DEN麻油組、nano-DEN組小鼠體重?zé)o明顯差異，而DEN水溶組及高劑量DEN麻油組小鼠體重均明顯低于正常組小鼠。各組體重變化，見(jiàn)圖1 A, B。

2.2各組小鼠存活率

造模過(guò)程中，正常組、納米載體組、低劑量DEN麻油組、nano-DEN組均未出現(xiàn)小鼠死亡，未發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生。20周時(shí)，DEN水溶組小鼠的死亡率為75%(圖1 C)，存活4只小鼠均有肉眼可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)；高劑量DEN麻油(7次/周)組小鼠死亡率為75%，存活4只小鼠均有肉眼可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)；高劑量DEN麻油(3次/周)組小鼠的死亡率為37.5%，存活10只小鼠中有5只肉眼可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，有1只小鼠雖未見(jiàn)肉眼腫瘤結(jié)節(jié)，但鏡下可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)；高劑量DEN麻油(1次/周)組小鼠的死亡率為25%，存活12只小鼠中有5只肉眼可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)。

注: A.正常組(NG)；B. DEN水溶組(DWG)；C. 高劑量DEN麻油每周7次組(HDO7G)；D. 高劑量DEN麻油每周3次組(HDO3G)；E. 高劑量DEN麻油每周1次組(HDO1G)；F. 低劑量DEN麻油每周1次組(LDO1G)；G. 納米載體組(NVG)；H.納米DEN每周1次組(NDG)。與正常組比較，***P<0.001。圖1　誘癌過(guò)程中各組小鼠的體重變化及死亡率Note. NG: Normal group; NVG: Nano-vehicle group; HDO7G: High-dose DEN-oil (7 times per week) group; HDO3G: High-dose DEN-oil (3 times per week) group; HDO1G: High-dose DEN-oil (once per week) group; LDO1G: Low-dose DEN-oil (once per week) group; NG1G: Nano-DEN (once per week) group. ***P<0.001, compared with the normal group.Fig. 1　The changes of body weight (A, B) and survival rates (C) of mice in various groups during the liver carcinogenesis.

2.3小鼠肝臟肉眼和病理觀(guān)察

注：(A)和(B)中，a.正常組；b.納米載體組；c.DEN水溶組；d.高劑量DEN麻油每周7次組；e.高劑量DEN麻油每周3次組；f.高劑量DEN麻油每周1次組；g.低劑量DEN麻油每周1次組；h.納米DEN每周1次組。(B)中標(biāo)尺為100 μm，右上角為黑框中所示局部圖(×100)的放大圖(×400)。圖2　20周時(shí)，各組小鼠肝臟肉眼觀(guān)及肝臟組織病理學(xué)觀(guān)Note. (A, B) a: Normal group; b: Nano-vehicle group; c: High-dose DEN-oil (7 times per week) group; d: High-dose DEN-oil (3 times per week) group; f: High-dose DEN-oil (once per week) group; g: Low-dose DEN-oil (once per week) group; h: Nano-DEN (once per week) group. (B) Part of the arbor (stippled outline, ×100) is shown enlarged in the inset (×400) in the top right-hand corner, Scale bar=100 μm.Fig. 2　Representative pictures of the gross liver appearance (A) and their histological images (B)(HE staining) from various groups at the 20th week.

肝臟組織標(biāo)本的肉眼觀(guān)察，正常組及納米載體組小鼠肝臟色澤鮮紅，表面光滑，質(zhì)地柔軟，未見(jiàn)任何病變，見(jiàn)圖2 A(a, b)。而前期死亡小鼠大體檢查則見(jiàn)其肝臟腫大、顏色偏黃，部分可見(jiàn)邊緣發(fā)黑。水溶DEN及高劑量DEN麻油組肉眼均可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)。小鼠肝臟表面較多結(jié)節(jié)，表面粗糙，色彩暗淡，可見(jiàn)多個(gè)大小不一的灰白色圓形結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖2A(c, d, e, f)。另有小鼠肉眼未見(jiàn)肝臟腫瘤結(jié)節(jié)，但肝臟表面粗糙，顏色暗淡。Nano-DEN組小鼠肝臟體積增大，肉眼可見(jiàn)白色顆粒，見(jiàn)圖2A(h)。其余臟器肉眼觀(guān)未見(jiàn)其他腫瘤結(jié)節(jié)發(fā)生。

光鏡下觀(guān)察，正常及納米載體組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，核大小一致，且分布均勻，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈，呈放射狀分布，肝竇清晰，見(jiàn)圖2B(a, b)。而前期死亡小鼠肝組織鏡檢則可見(jiàn)急性大面積肝細(xì)胞腫脹、壞死，尚未見(jiàn)腫瘤形成。DEN水溶及高劑量DEN麻油組小鼠，明顯可見(jiàn)具有被膜形成的結(jié)節(jié)灶，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，大小、形態(tài)各異，染色質(zhì)明顯增粗，胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)病理性核分裂像，分化較差的肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)巨核，表明細(xì)胞異型性明顯，見(jiàn)圖2B(c, d, e, f)。低劑量DEN麻油組及nano-DEN組出現(xiàn)肝細(xì)胞變性壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，大量空泡脂肪變性，且nano-DEN組較經(jīng)口低劑量組嚴(yán)重，見(jiàn)圖2B (g, h)。

3討論

化學(xué)誘導(dǎo)型肝癌模型是研究肝癌最好的模型之一，DEN是迄今應(yīng)用最廣泛的一種化學(xué)誘導(dǎo)型肝癌模型制劑[10]。并且亞硝胺類(lèi)化合物普遍存在于谷物、牛奶、干酪、煙酒、熏肉、烤肉、海魚(yú)、罐裝食品以及飲水中[11]。傳統(tǒng)造模方法將DEN溶于水中，給予小鼠自由飲用，但是往往實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng)，個(gè)體差異大，且死亡率高[12]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于多種條件的限制，尤其是實(shí)踐方面，死亡率方面的制約，要求我們必須建立更好、更快的造模方法。本實(shí)驗(yàn)的研究思路圍繞該目的所展開(kāi)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)造模方法即將DEN溶于水中給予小鼠自由飲用，小鼠順應(yīng)性差，個(gè)體差異大，且死亡率高。通過(guò)將DEN溶于麻油經(jīng)口給藥增加了小鼠服藥的順應(yīng)性，克服了DEN水溶造模小鼠之間的個(gè)體差異。二十周時(shí)，DEN水溶組及經(jīng)口高劑量組小鼠肉眼均可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，但1次/周經(jīng)口給藥組小鼠死亡率最低，即長(zhǎng)期低頻給藥能大大降低造模過(guò)程中的死亡率。

為了更好地模擬人們可能因長(zhǎng)期接觸環(huán)境中有毒、有害化學(xué)物質(zhì)，以及長(zhǎng)期服用肝毒性藥物造成肝臟損傷甚至肝癌的情況，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立了低劑量DEN麻油組及nano-DEN組。二十周時(shí)，低劑量DEN麻油組及nano-DEN組小鼠肝臟均見(jiàn)細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及脂肪化，且nano-DEN組較低劑量DEN麻油組嚴(yán)重。表明DEN經(jīng)納米化后對(duì)肝臟產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷。Nano-DEN有望作為建立原發(fā)性肝癌更好的誘導(dǎo)劑。

理想的肝癌動(dòng)物模型應(yīng)與人類(lèi)大多數(shù)肝癌病理組織類(lèi)型相一致，具有合適的腫瘤體積、生長(zhǎng)速度和存活時(shí)間，腫瘤的組織類(lèi)型、生物學(xué)特點(diǎn)應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，復(fù)制迅速，成功率高，重復(fù)性好[13]。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的KM小鼠，以DEN為誘癌劑，通過(guò)經(jīng)口給藥，20周時(shí)成功建立了小鼠原發(fā)性肝癌模型，并克服了DEN水溶造模的缺陷。由于誘導(dǎo)肝癌是通過(guò)小劑量長(zhǎng)時(shí)間的刺激肝臟癌變，一般實(shí)驗(yàn)時(shí)間需要18～24周，而將DEN納米化后，能增強(qiáng)DEN對(duì)肝臟的損傷作用，因此nano-DEN有望能在更短時(shí)間內(nèi)建立原發(fā)性肝癌動(dòng)物模型。

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Optimization of the establishment method of mouse model of hepatocellular carcinoma

GU HONG-wei, CHEN QI, ZHANG WEI, LI Yu-sang*, TANG He-bin

(Department of Pharmacology, College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

【Abstract】ObjectiveTo develop an efficient, fast and stable establishment method of mouse model of hepatocellular carcinoma. Methods 128 healthy Kunming male mice were equally divided into eight groups: normal group supplied with routine drinking water and food; diethylnitrosamine (DEN)-water group received 16.5 mg/kg DEN in drinking water every day; high-dose DEN-oil groups received orally 16.5 mg/kg of DEN oil solution once, 3 times and 7 times per week, respectively; low-dose DEN-oil group and nano-DEN group received orally 8.25 mg/kg DEN in oil or in nano-vehicle every week, while nano-vehicle group received only an equal amount of nano-vehicle. After twenty weeks, all mice were sacrificed. The paraffin-embedded mouse liver specimens were examined by pathology using HE staining. Results (1) The mice treated with DEN solution showed dry and dull hair, slow movement and slow weight-gain to a varying degree. (2) At the twentieth week, both the DEN-water group and high-dose DEN-oil group showed tumors, and the mortality of high-dose DEN-oil group (once per week) was low. (3) There was no death of mice in the nano-DEN group, and the pathological examination revealed more serious liver injury in the nano-DEN group than in the low-dose DEN-oil group (once per week). Conclusions Oral administration of DEN-oil improved the dietary compliance of mice, and the mortality can be reduced significantly by long-term low frequency DEN administration. Microemulsion preparation of DEN dissolved in oil may enhance the DEN-induced liver damage.

【Key words】Diethylnitrosamine; Hepatocellular carcinoma; Nano-diethylnitrosamine

[收稿日期]2015-09-01

Corresponding author:LI Yu-sang, E-mail: liys2006@mail.scuec.edu.cn

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.004

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2016) 01-0020-05

[作者簡(jiǎn)介]顧洪偉(1990-)，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)：中藥藥理。E-mail: ghw901025@126.com[通訊作者]李玉桑(1972-)，女，教授，研究方向：原發(fā)性肝癌的形成機(jī)制與藥物干預(yù)。E-mail: liys2006@mail.scuec.edu.cn

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81101538; No. 81573887)；中南民族大學(xué)中央高?？蒲谢?No.CZZ15007)；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 2015CFB496)。