陳旺，李陳成，李森，馮東亮，洪有建,南偉，江龍，黃顯凱,伍亞民

(1. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷外科， 重慶　400042；2. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所第三研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶　400042；3. 蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院骨科， 蘭州　730030)

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研究報(bào)告

復(fù)合刺激創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠重要腦區(qū)的病理變化

陳旺1,2，李陳成1,2，李森2，馮東亮3，洪有建1,2,南偉3，江龍1,2，黃顯凱1*,伍亞民2

(1. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷外科， 重慶400042；2. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所第三研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶400042；3. 蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院骨科， 蘭州730030)

【摘要】目的研究復(fù)合刺激創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)模型大鼠重要腦區(qū)的病理變化。方法成年SD雌性大鼠20只，隨機(jī)分為正常組、模型組，每組10只。模型組按復(fù)合刺激方法建立PTSD大鼠模型，4 周后對(duì)兩組大鼠行高架十字迷宮和Morris水迷宮檢測(cè)；行為檢測(cè)結(jié)束后對(duì)大鼠大腦皮層和海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和齒狀回進(jìn)行HE染色和Nissl染色，觀察其病理變化特點(diǎn)。結(jié)果正常組大腦皮層和海馬各區(qū)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、分布均勻，核仁及邊界清晰，胞質(zhì)尼氏體豐富，無(wú)明顯神經(jīng)元變性壞死；模型組大腦皮層細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則、分布均勻，無(wú)明顯病理改變；海馬CA1、CA3區(qū)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)量減少，有較多空泡樣細(xì)胞病變，CA3區(qū)更為明顯；CA2區(qū)細(xì)胞排列較規(guī)則，分布較均勻；齒狀回可見(jiàn)部分細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞間隙增大、尼氏體數(shù)量減少。結(jié)論P(yáng)TSD模型大鼠海馬CA1、CA3區(qū)和齒狀回均有不同程度的病理改變，為探討PTSD患者的病理機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；大腦皮層；海馬；病理學(xué)；大鼠

復(fù)合刺激(combined stress，CS)模型是一種新的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)動(dòng)物模型，與經(jīng)典的連續(xù)單一應(yīng)激模型(single-prolonged stress，SPS)比較：前者在禁錮時(shí)給予不可逃避的電刺激，能更好的模擬現(xiàn)實(shí)環(huán)境中多種應(yīng)激因素的作用，且在強(qiáng)迫游泳后省去了乙醚麻醉的步驟，避免了乙醚對(duì)大腦的直接影響。因此，CS模型在造模方法上能更好模擬人類發(fā)生PTSD的狀況。目前有報(bào)道PTSD患者可能存在重要腦區(qū)的實(shí)質(zhì)性損害，但尚存爭(zhēng)議，并沒(méi)有PTSD患者大腦的直接病理學(xué)證據(jù)。但這種模型大鼠重要腦區(qū)是否存在病理改變也不確定，相關(guān)研究的報(bào)道很少。為此,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察CS模型大鼠重要腦區(qū)的病理變化特點(diǎn)，為研究PTSD的病理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠20只，體重190～200 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(渝)2012-0005】。實(shí)驗(yàn)在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所【SYXK(軍)2012-0037】進(jìn)行，環(huán)境為室溫(20±2)℃，濕度(55～60)%，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。將20只大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本研究得到第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)(SYXK-PLA-20120031)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作均按減少動(dòng)物使用數(shù)量和減輕動(dòng)物受傷害的原則進(jìn)行。

1.1.2主要儀器及試劑

高架十字迷宮(垂直方向?yàn)殚_(kāi)臂× 50 cm，水平方向?yàn)殚]臂× 50 cm，中央為10 cm × 10 cm正方形區(qū)域)，水迷宮(直徑135 cm，高80 cm的圓柱形水池)，Smart行為軌跡分析系統(tǒng)(San Diego Instrument，美國(guó))，DCR-TRV318紅外攝像機(jī)(Sony公司，日本)，大鼠玻璃禁錮器，HE染色試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，尼氏染液(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2PTSD動(dòng)物模型的建立

采用趙中興[1]所用的復(fù)合刺激(CS)模型，方法如下：用玻璃禁錮器將大鼠禁錮2 h，期間給予大鼠足部電擊(4 mA，60 V)持續(xù)2 s，電擊間隔時(shí)間為30～120 s，禁錮結(jié)束后將大鼠取出進(jìn)行力竭式游泳(大鼠放棄掙扎沉入水底10 s視為力竭)，造模結(jié)束后將大鼠放回原籠內(nèi)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)條件不變。

1.3行為學(xué)檢測(cè)

1.3.1高架十字迷宮

將大鼠放入迷宮中央使其頭正對(duì)其中一個(gè)開(kāi)臂，同時(shí)Smart軟件記錄大鼠在5 min內(nèi)進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂次數(shù)總和以及在閉臂停留時(shí)間百分比，以此來(lái)反映大鼠的焦慮性。每只大鼠實(shí)驗(yàn)完畢后均需清理迷宮內(nèi)的糞便和尿液，并用75%酒精擦拭迷宮，防止對(duì)下一只大鼠行為檢測(cè)產(chǎn)生影響。

1.3.2水迷宮

將水迷宮的四個(gè)象限定義為東(E)、南(S)、西(W)、北(N)四個(gè)象限，于各自象限的池臂上放置四種不同顏色的標(biāo)記物，作為大鼠的視覺(jué)參照。將平臺(tái)(40 cm高)放入水迷宮的西南象限，水池內(nèi)注入自來(lái)水至水深超過(guò)平臺(tái)2 cm，為防止大鼠看見(jiàn)水下平臺(tái)將墨汁倒入水池內(nèi)，調(diào)節(jié)水溫在22～25℃之間。

1.3.3定位航行實(shí)驗(yàn)

歷時(shí)4 d，每只大鼠每天訓(xùn)練4次，第1天按E→S→W→N的順序?qū)⒋笫笱爻乇陬^朝上輕輕放入水中，同時(shí)Smart軟件記錄大鼠的行為軌跡，若大鼠找到水下平臺(tái)則記錄自動(dòng)終止，若大鼠在1 min內(nèi)仍未找到水下平臺(tái)，則人為誘導(dǎo)其找到平臺(tái)并在平臺(tái)上休息20 s。每只大鼠訓(xùn)練完后均需清理水池內(nèi)的糞便。第2天按S→W→N→E的順序開(kāi)始訓(xùn)練，以此類推。

1.3.4空間探索實(shí)驗(yàn)

訓(xùn)練結(jié)束后的第2天，取走水下平臺(tái)，將大鼠沿原平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限放入水池內(nèi)，同時(shí)Smart軟件記錄大鼠在1 min內(nèi)的行為軌跡，每只大鼠實(shí)驗(yàn)完后均需清理水池內(nèi)的糞便。通過(guò)分析大鼠在1 min內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)和在靶象限停留時(shí)間來(lái)反映大鼠的空間記憶能力。

1.4HE染色和Nissl染色

大鼠行為檢測(cè)結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉兩組大鼠。麻醉起效后，仰臥固定，立即剖開(kāi)胸腔暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，在左心室剪開(kāi)一個(gè)小口，僅容灌注針頭進(jìn)入，針頭經(jīng)切口進(jìn)入左心室到達(dá)升主動(dòng)脈，灌注生理鹽水直至右心耳流出無(wú)色液體，然后以4%多聚甲醛灌注定直至灌注液進(jìn)入大鼠大腦，抽動(dòng)完全停止，全身組織變硬后方可取腦。將取出的腦組織在4%多聚甲醛中固定2 d，隨后沖洗、脫水、透明、侵蠟、包埋、切片(HE染色5 μm，尼氏染色10 μm)、染色。 分別對(duì)兩組大鼠的大腦皮層和海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和齒狀回進(jìn)行HE染色和Nissl染色，顯微鏡在200倍下觀察其病理變化特點(diǎn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1高架十字迷宮

與正常組比較，模型組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂次數(shù)，閉臂停留時(shí)間百分比均增多，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示模型組大鼠活動(dòng)性減少，焦慮性增加(見(jiàn)表1、圖1)。

2.2水迷宮

與正常組比較，模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和靶象限停留時(shí)間百分比均減少，差異有顯著性(P<0.01)，提示模型組大鼠空間記憶能力受損(見(jiàn)表2、圖2)。

表1　高架十字迷宮的比較

注：與正常組相比，*P<0.01。

Note.*P<0.01, vs.the control group.

表2　Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)的比較(x± s，n=10)

Tab. 2　Comparison of space exploration test in the Morris water maze

表2　Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)的比較(x± s，n=10)

組別Groups穿越平臺(tái)次數(shù)Numbersofplatformcrossing靶象限停留時(shí)間百分比Percentageofresidencetimeintargetzone正常組Controlgroup3.10±1.1936.33±3.25模型組Modelgroup1.50±0.85*28.46±3.69*

注：與正常組相比，*：P<0.01。

Note.*P<0.01, vs. the control group.

圖1　大鼠高架十字迷宮5 min 的行為軌跡Fig.1　The behavior trace of rats tested by elevated plus maze for 5 minutes

圖2　大鼠空間探索實(shí)驗(yàn) 1 min 的行為軌跡Fig.2　The behavior trace of rats on space exploration test for one minute.

2.3重要腦區(qū)病理染色

兩組大鼠大腦皮層，海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和齒狀回HE染色和Nissl染色結(jié)果如下：正常組大腦皮層和海馬各區(qū)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、分布均勻、排列緊密，核仁及邊界清晰，胞質(zhì)尼氏體豐富，無(wú)明顯神經(jīng)元變性壞死；模型組大腦皮層細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則、分布均勻，無(wú)明顯病理改變；但模型組大鼠海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)層變薄，CA1、CA3區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)量減少，有較多空泡樣細(xì)胞病變，CA3區(qū)更為明顯；CA2區(qū)細(xì)胞排列較規(guī)則，分布較均勻；齒狀回可見(jiàn)部分細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞間隙增大、尼氏體數(shù)量減少(見(jiàn)圖3)。

3討論

PTSD是延遲出現(xiàn)和長(zhǎng)期存在的精神障礙，其核心癥狀表現(xiàn)為再體驗(yàn)、高警覺(jué)和回避[2]。當(dāng)今社會(huì)，自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭(zhēng)、恐怖襲擊、重大交通事故等頻繁發(fā)生，使PTSD的患病率持續(xù)升高。研究發(fā)現(xiàn)，8%～9%的人在一生中的某些時(shí)候會(huì)遭遇比較強(qiáng)烈的應(yīng)激事件，最終有可能發(fā)展成PTSD[3,4]。PTSD由于其病程長(zhǎng)、治療困難、預(yù)后不佳，已成為社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)，受到越來(lái)越多的重視。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)PTSD發(fā)生機(jī)制的研究已引起廣泛關(guān)注，fMRI等影像學(xué)檢測(cè)提示PTSD患者可能有重要腦區(qū)的損害，但尚存爭(zhēng)議。因此，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)模擬、探索PTSD發(fā)生的特點(diǎn)、機(jī)制十分必要。在本模型中，CS大鼠能很好復(fù)制出PTSD樣行為表現(xiàn)，通過(guò)對(duì)其重要腦區(qū)的病理進(jìn)行直接觀察，發(fā)現(xiàn)CS模型大鼠HE染色后海馬CA1和CA3區(qū)呈現(xiàn)出一定的病理改變，可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞核碎裂、溶解，空泡細(xì)胞形成。尼氏小體與神經(jīng)元的功能密切相關(guān)，當(dāng)神經(jīng)元變性時(shí)，尼氏小體會(huì)變小甚至消失，尼氏小體的數(shù)量直接反映了神經(jīng)元內(nèi)的蛋白合成功能[11]。CS模型大鼠Nissl染色后可見(jiàn)CA1和CA3區(qū)的尼氏小體排列紊亂、數(shù)量明顯減少、顏色變淺，CA3區(qū)更為明顯。另外，齒狀回的某些區(qū)域也出現(xiàn)了尼氏小體排列疏松、數(shù)量減少的現(xiàn)象。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，其最顯著的特點(diǎn)是神經(jīng)元緊密排列，使其結(jié)構(gòu)層次分明、邊界清晰，因此在PTSD腦結(jié)構(gòu)的研究中得到了最多的關(guān)注。海馬的主要結(jié)構(gòu)有三層，即多形層、椎體層和分子層，齒狀回則主要分為多形層、顆粒層和分子層。海馬各個(gè)區(qū)域的細(xì)胞類型也是不同的：CA1區(qū)的椎體細(xì)胞比較小，CA3區(qū)的椎體細(xì)胞較大，A2區(qū)界于CA1區(qū)和CA3區(qū)之間，由大小不等的椎體細(xì)胞組成。

海馬有很多重要的生理功能，它影響著軀體活動(dòng)和行為、內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)、自主神經(jīng)功能以及學(xué)習(xí)記憶。海馬在動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮著重要作用，尤其是CA3區(qū)，對(duì)空間記憶的辨別至關(guān)重要[5]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海馬受到損傷后將影響短時(shí)記憶向長(zhǎng)時(shí)記憶的轉(zhuǎn)化[6]。海馬對(duì)應(yīng)激非常敏感，極易受到應(yīng)激的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)膽?yīng)激有利于學(xué)習(xí)記憶的改善，對(duì)大腦退化有積極的防治作用[7]；而強(qiáng)烈的應(yīng)激事件則會(huì)損害其學(xué)習(xí)記憶功能[8]。海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)學(xué)基礎(chǔ)，Sousa等[9]認(rèn)為應(yīng)激能抑制CA1區(qū)和齒狀回誘發(fā)LTP，而Kadar等[10]則認(rèn)為應(yīng)激能抑制CA3區(qū)和齒狀回誘發(fā)LTP。

綜上所述，CS模型大鼠海馬的不同區(qū)域均發(fā)生了不同程度的病理改變，海馬CA1、CA3、齒狀回等區(qū)受損明顯，導(dǎo)致較多神經(jīng)元的變性壞死，這在一定程度上可以解釋其在進(jìn)行高架十字迷宮和水迷宮時(shí)的行為表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：PTSD模型大鼠同樣存在重要腦區(qū)的病理性損害，為探討PTSD患者的發(fā)病機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但此模型對(duì)大腦產(chǎn)生的應(yīng)激損傷可能不僅僅在于海馬，PTSD影響的另外一個(gè)重要腦區(qū)是杏仁核，但由于其體積太小、位置隱匿，在研究中有一定的困難，本次實(shí)驗(yàn)尚未對(duì)其觀察，CS模型大鼠杏仁核是否存在病理?yè)p害有待以后深入研究。

圖3　大鼠重要腦區(qū)的組織學(xué)改變(HE與Nissl染色，×200)Fig.3　Histological changes in the brain areas of rats. HE and Nissl staining. ×200

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Pathological changes in some important brain areas of rats with post-traumatic stress disorder induced by combined stress

CHEN Wang1，LI Chen-cheng1，LI Sen2，F(xiàn)ENG Dong-liang2，HONG You-jian1， NAN Wei2，JIANG Long1，HUANG Xian-kai1*，WU Ya-min1

(1. Department of Traumatology, Research Institute of Surgery/Daping Hospital,2. Third Department of Research Institute of Surgery/Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China；3. Department of Orthopedics, the Second Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhou 730030)

【Abstract】ObjectiveTo study the pathological changes in some important brain areas of rats with post-traumatic stress disorder (PTSD) induced by combined stress.MethodsTwenty healthy adult female SD rats were randomly divided into normal group and model group, with 10 rats in each group. The PTSD model was established by combined stress. After 4 weeks, the rat behaviors of the two groups were tested by elevated plus maze and Morris water maze. After the test, samples of the cerebral cortex, areas of CA1, CA2, CA3 and hippocampal dentate gyrus were taken for pathological examination using HE and Nissl staining. ResultsIn the normal group, the cell morphology and distribution were regular and the cell nucleoli were clear in the cerebral cortex and hippocampus, cytoplasmic Nissl bodies were abundant, and there were no obvious neuronal degeneration and necrosis. In the model group, the cell morphology and distribution in the CA1 and CA3 areas were irregular, with increased cell gaps, and in addition, there were some pathological changes of physaliferous cells, especially in the CA3 area. The cell morphology and distribution in the CA2 area were regular. In the dentate gyrus, some cells arranged loosely, the cell gap was widened, and the amount of Nissl bodies was decreased. Conclusions There are some pathological changes in the hypocampal CA1, CA3 and dentate gyrus in rat models of post-traumatic stress disorder, and they will provide an experimental basis for studying the pathological mechanism of PTSD patients.

【Key words】Post-traumatic stress disorder; Cerebral cortex; Hippocampus; Pathology; Rats

[收稿日期]2015-08-06

Corresponding author:HUANG Xian-kai, E-mail：hxkai123@sina.com

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.016

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2016) 01-0087-05

[作者簡(jiǎn)介]陳旺(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：PTSD的防治。E-mail: 453777442@qq.com[通訊作者]黃顯凱，主任醫(yī)師、教授、博士、碩士生導(dǎo)師，研究方向：嚴(yán)重創(chuàng)傷救治。E-mail: hxkai123@sina.com

[基金項(xiàng)目]全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(08G096)。