陸玲玲

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧　錦州　121000)

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人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉(zhuǎn)移的影響

陸玲玲

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的探討人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉(zhuǎn)移的影響。方法分別將人參皂甙Rg3和索拉非尼兩種單藥、兩藥聯(lián)合方式作用于人肝癌細胞，觀察其對細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果作用1 h，索拉非尼組黏附抑制率顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.05或<0.01)，聯(lián)合組顯著高于索拉非尼組和人參皂苷Rg3組(P<0.01)；作用2 h，人參皂苷Rg3組抑制率顯著高于索拉非尼組(P<0.01)，并且高于人參皂苷Rg3組作用1 h(P<0.01)；兩藥聯(lián)合對肝癌細胞的黏附抑制率具有協(xié)同作用(Q=2.63>1.15)。索拉非尼單藥及索拉非尼聯(lián)合人參皂苷Rg3對肝癌細胞的遷移抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3單藥作用(P<0.01)，并且兩藥聯(lián)合的抑制率顯著高于索拉非尼單藥組(P<0.01)；兩藥聯(lián)合對肝癌細胞的遷移抑制作用具有協(xié)同作用(Q=1.46>1.15)。索拉非尼組和聯(lián)合組侵襲抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.01)，兩藥聯(lián)合對肝癌細胞的侵襲抑制作用具有拮抗作用(Q=0.71<0.85)。與陰性對照組比較，人參皂苷Rg3組CD44V6、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9表達水平顯著下降，索拉非尼組和聯(lián)合組血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C、CD44V6及MMP-9表達均顯著下降(P<0.05)；與人參皂苷Rg3組比較，聯(lián)合組VEGF-C及CD44V6水平顯著下降；與索拉非尼組比較，聯(lián)合組VEGF-C水平顯著下降(P<0.05)。結(jié)論人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及兩藥聯(lián)合對肝癌細胞SMMC-7721細胞株的黏附、遷移、侵襲具有一定的抑制作用，對細胞的黏附和遷移抑制作用兩者均具有協(xié)同作用。

〔關(guān)鍵詞〕人參皂苷Rg3；索拉非尼；肝癌細胞；侵襲；轉(zhuǎn)移

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜，黏附、降解、運動、新生血管形成等參與了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。肝細胞癌是臨床常見腫瘤，并且根治性切除后具有較高的復(fù)發(fā)率，而局部治療的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率更高。人參皂苷Rg3對腫瘤細胞有抑制作用，可通過抑制腫瘤新血管生成抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)〔1，2〕。索拉非尼是一種新型的多靶向抗癌藥物，選擇性作用于一些蛋白的受體，而這些蛋白受體在腫瘤細胞的生長過程中發(fā)揮分子開關(guān)樣作用〔3，4〕。本研究主要研究人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉(zhuǎn)移的影響。

1材料與方法

1.1材料及試劑試驗細胞為人肝癌SMMC-7721細胞株，由上海細胞生物研究所提供。人參皂苷Rg3由上海撫生生物科技有限公司提供。索拉非尼(德國Bayer Schering pharma AG，批號：201304211)。培養(yǎng)基、胎牛血清由環(huán)凱微生物科技提供。CD44V6兔抗人多克隆抗體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C兔抗人多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9兔抗人多克隆抗體由上海紫域生物科技有限公司提供。CO2培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；自動酶標讀數(shù)儀：深圳市愛康生物科技有限公司；高速冷凍離心機：北京時代北利離心機有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)肝癌細胞株接種于培養(yǎng)瓶后，加培養(yǎng)液，放入37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。覆蓋瓶底的80%后開始傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于研究。

1.3分組方法根據(jù)作用藥物的不同，分為人參皂苷Rg3組、索拉非尼組、聯(lián)合組及陰性對照組。參考文獻〔5〕選擇藥物濃度為對肝癌細胞株24 h增殖抑制率<15%，人參皂苷Rg3濃度7.5 μg/ml，索拉非尼濃度1.25 μmol/L。

1.4MTT比色法檢測各組細胞黏附實驗對數(shù)生長的肝癌細胞株接種于培養(yǎng)瓶中，細胞濃度3×104個/ml，培養(yǎng)瓶含等量的培養(yǎng)液。放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2，24 h后根據(jù)設(shè)定的分組，加入相應(yīng)的藥物，陰性對照組加培養(yǎng)液。放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。包被基底膜，加入96孔板，每孔30 μl，4℃過夜，水化基地膜。消化藥物處理后的接種細胞，培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為2×105個/ml，接種于包被基底膜的96孔板內(nèi)，100 μl/孔，每組設(shè)5個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)1和2 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。采用MTT比色法檢測黏附情況。培養(yǎng)后1和2 h，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加20 μl的濃度為5 mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加100 μl的鹽酸異丙醇，混勻。在波長570 nm處讀吸光度值。計算黏附抑制率=〔1-(實驗組吸光度值-空白孔吸光度值)〕/(陰性對照組吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。

1.5Transwell小室實驗檢測各組細胞遷移情況采用Transwell小室實驗計算各組遷移率。對數(shù)生長期細胞去除含有血清的培養(yǎng)液，換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，調(diào)整細胞密度為1.0×105個/ml，取100 μl加入Transwell小室，加入對應(yīng)的藥物，對照組加培養(yǎng)液，均為100 μl，每組設(shè)5個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。Transwell小室的下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μl，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。24 h后取出，擦去未遷移的細胞，結(jié)晶紫染色，PBS沖洗。在顯微鏡下計數(shù)小室外底部細胞數(shù)，每個樣本去3個視野取平均數(shù)為發(fā)生遷移的細胞數(shù)，計算遷移抑制率。遷移抑制率=〔1-(實驗組穿膜細胞數(shù)/對照組的穿膜細胞數(shù))〕×100%。

1.6Transwell小室實驗檢測各組細胞侵襲實驗對數(shù)生長細胞去除含有血清的培養(yǎng)液，換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。將融化稀釋的Matrigel基質(zhì)膠30 μl加入Transwell小室，37℃孵育2 h；取50 μl濃度為10 mg/L纖維連接蛋白溶液包被小室反面，風干。調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，取100 μl加入小室，加相應(yīng)的藥物100 μl，對照組加培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔。小室下室加含20%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μl。培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。取出小室，擦去上室未遷移細胞，風干，結(jié)晶紫染色，PBS沖洗。顯微鏡下計數(shù)細胞，每個樣本取3個視野，計數(shù)侵襲細胞數(shù)，計算侵襲抑制率。抑制率=〔1-(實驗組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù))〕×100%。

1.7采用免疫細胞化學(xué)法檢測VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達調(diào)整細胞密度為3×104個/ml。1.5 ml細胞懸液計入6孔板，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。加對應(yīng)藥物1.5 ml，對照組加培養(yǎng)液1.5 ml，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。棄上清，固定細胞，將細胞爬片加PBS覆蓋，15 min后PBS沖洗3次，加0.1%的triton-100，放置15 min，PBS浸泡5 min，沖洗3次，加3%H2O2-甲醇溶液浸泡10 min，PBS沖洗3次，加一抗，4℃過夜，PBS沖洗3次，加增強劑孵育20 min，PBS沖洗3次，加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色。染色成功后終止染色。加蘇木素復(fù)染30 min，蒸餾水沖洗，封片。CD44V6定位于細胞膜上，呈棕黃色，也可見細胞質(zhì)內(nèi)，MMP-9和VEGF-C定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色。在200倍視野下取細胞分布均勻視野10個，根據(jù)著色強度計分：無0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕色3分。計算HSCORE得分。HSCORE=∑Pi(i+1)，i為計分，Pi為得分為i的比例。

1.8兩藥聯(lián)合作用判斷Q=聯(lián)合抑制率/〔人參皂苷Rg3單藥抑制率+(1-人參皂苷Rg3單藥抑制率)×索拉非尼單藥抑制率〕，Q>1.15為協(xié)同作用，<0.85為相互拮抗作用，0.85~1.15為相加作用。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行F檢驗，t檢驗。

2結(jié)果

2.1各組黏附抑制率比較作用1 h，索拉非尼組黏附抑制率顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.05)，聯(lián)合組顯著高于索拉非尼組和人參皂苷Rg3組(P<0.01)；作用2 h，人參皂苷Rg3組抑制率顯著高于索拉非尼組(P<0.01)；并且高于人參皂苷Rg3組作用1 h(P<0.01)。見表1。兩種藥物聯(lián)合作用1 h Q=2.63，>1.15，說明兩藥聯(lián)合對肝癌細胞的黏附抑制率具有協(xié)同作用。

表1　各組黏附抑制率、遷移抑制率、侵襲抑制率比較±s)

與人參皂苷Rg3組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與索拉非尼組比較：3)P<0.05

2.2各組遷移抑制率比較索拉非尼單藥及索拉非尼聯(lián)合人參皂苷Rg3對肝癌細胞的遷移抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3單藥作用(P<0.01)，并且兩藥聯(lián)合的抑制率顯著高于索拉非尼單藥(P<0.01)。見表2。Q=1.46>1.15，提示兩藥聯(lián)合對肝癌細胞的遷移抑制作用具有協(xié)同作用。見表1。

2.3各組侵襲抑制率比較索拉非尼組和聯(lián)合組侵襲抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.01)。見表1。Q=0.710，<0.85，提示兩者聯(lián)合對肝癌細胞侵襲抑制作用具有拮抗作用。

2.4各組VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達HSCORE評分與陰性對照組比較，人參皂苷Rg3組CD44V6、MMP-9表達水平顯著下降，索拉非尼組和聯(lián)合組VEGF-C、CD44V6及MMP-9表達均顯著下降(P<0.05)；與人參皂苷Rg3組比較，聯(lián)合組VEGF-C及CD44V6水平顯著下降；與索拉非尼組比較，聯(lián)合組VEGF-C水平顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2　各組VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達

與陰性對照組比較：1)P<0.05；與人參皂苷Rg3組比較：2)P<0.05；與索拉非尼組比較：3)P<0.05

3討論

近年來中醫(yī)中藥的抗癌作用以其副作用小、作用溫和等優(yōu)點逐漸受到關(guān)注。人參皂苷 Rg3是人參中的有效活性成分，具有抗腫瘤的作用。索拉非尼是一種新型的多靶向治療的抗腫瘤藥物。

本研究中，人參皂苷 Rg3和索拉非尼對肝癌細胞的黏附均具有一定的抑制作用。人參皂苷Rg3在2 h時的抑制率顯著高于1 h的抑制率，而索拉非尼抗黏附作用的時間依賴性不明顯，具體原因期望在今后的研究中進一步明確。人參皂苷Rg3能夠促進NO產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞的凋亡，其次能夠抑制癌癥細胞對細胞外基質(zhì)的黏附作用，抑制腫瘤新生血管的形成，并降低細胞內(nèi)的Ca2+〔6，7〕。本次研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3對肝癌細胞的黏附抑制作用相對較為溫和，單藥使用時作用相對較弱，而聯(lián)合索拉非尼能夠顯著增加抑制率，并且兩者有協(xié)同作用。

Transwell小室遷移實驗是計數(shù)穿膜細胞個數(shù)，定量計算藥物對細胞的遷移能力的影響。本研究顯示索拉非尼和人參皂苷Rg3聯(lián)合對肝癌細胞侵襲的抑制作用具有一定拮抗作用。

原發(fā)性肝癌侵襲過程中有多種黏附分子參與其中。CD44是一種細胞膜跨膜蛋白，也是一種黏附分子，CD44V6(CD44基因含v6外顯子的變異體)，其變異部分位于細胞外，對黏附作用有顯著的影響，介導(dǎo)轉(zhuǎn)移，參與細胞與細胞，細胞與基質(zhì)之間的黏附，與肝癌細胞血管浸潤具有密切的關(guān)系〔8，9〕。MMP-9屬于MMPs家族成員。MMPs在肝癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移過程及新生血管形成過程中發(fā)揮降解基質(zhì)的作用，能夠降解幾乎所有的血管基底膜及細胞外基質(zhì)〔10，11〕。另外其還具有升高血管生長因子的作用，調(diào)節(jié)細胞生長、促進血管生成，這些均在肝癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。MMP-9主要降解破壞細胞外基質(zhì)中Ⅳ型和Ⅴ型膠原及透明質(zhì)酸〔12，13〕。VEGF在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中的血管生成過程中具有重要的促進作用，是內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原，能夠誘導(dǎo)血管形成及血管的通透性〔14，15〕。在早期，其還能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞生成MMPs和組織因子，間接激活明膠酶原A降解基膜，從而促進細胞增殖。目前已知新生血管的生成是抗腫瘤治療的重要的靶點之一。

綜上，人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及兩藥聯(lián)合對肝癌細胞SMMC-7721細胞株的黏附、遷移、侵襲具有一定的抑制作用，對細胞的黏附和遷移抑制作用兩者均具有協(xié)同作用，而其對肝癌細胞遷移、侵襲的抑制作用可能與降低細胞VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達水平有關(guān)。

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〔2014-11-21修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1067-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.020

第一作者：陸玲玲(1985-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事免疫性疾病研究。