程 乾，周 婕，柴大飛△，鄭駿年△

1.徐州醫(yī)科大學(xué) 腫瘤研究所(徐州 221002)；2.徐州市科技情報(bào)研究所(徐州 221000)

腎癌在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)生率高居第3位，發(fā)病率在惡性腫瘤中占3%～5%[1]，25%～30%患者在就診時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[2]。由于腎癌對(duì)放、化療不敏感，這使腎癌的臨床治療成為一大難題[3]，因此，需探索新的治療腎癌方案應(yīng)用于臨床。索拉非尼作為一線治療和免疫治療失敗病人二線治療的靶向藥，治療轉(zhuǎn)移性腎癌的多激酶抑制劑，對(duì)細(xì)胞具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡及對(duì)血管具有生成抑制等作用，疾病控制率和無進(jìn)展生存期較好。但由于反應(yīng)率低、藥物抵抗性的原因，晚期腎癌患者的中位生存期也僅能延長(zhǎng)17.8～24.2個(gè)月[4-5]，因此針對(duì)索拉非尼耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的方案探尋，是提高索拉非尼在中晚期腎癌療效尤為重要的一環(huán)。缺氧是腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物治療產(chǎn)生耐藥的重要因素，在此環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor, HIF-1α)及HIF-2α蛋白表達(dá)增加、降解減少和穩(wěn)定性提高，HIF能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖與抑制凋亡、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，對(duì)抗腫瘤藥物有耐藥作用[6-7]。本研究旨在探討缺氧環(huán)境下，HIF-1α與HIF-2α的變化，以及敲減HIF-2α引起索拉非尼協(xié)同促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 人腎癌細(xì)胞(OS-RC-2、786-O)購(gòu)自中科院上海分院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 改良型RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：NZG1090)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：RB35932)；噻唑藍(lán)(MTT)(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：MTO792)；BCA試劑盒(中國(guó)Solarbio公司，貨號(hào)：PC0020)；流式凋亡試劑盒(江蘇凱基生物公司，批號(hào)：20191003)。慢病毒介導(dǎo)的shRNA：Control shRNA、HIF-1α shRNA、HIF-2α shRNA(美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-108080、sc-35561-V、sc-35316-V)；病毒轉(zhuǎn)染優(yōu)化劑聚凝胺(美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-134220)；HIF-1α、HIF-2α抗體(美國(guó)R&D公司，MAB1536、AF2997)；Caspase3抗體、GAPDH抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：AC030、AF1186)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司，貨號(hào)：G3250)；碘化丙啶(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：P4170-10MG)。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，型號(hào)：Canto Ⅱ)；三氣培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：3131)；化學(xué)發(fā)光儀(上海天能科技有限公司，型號(hào)：5200)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI 1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，常氧狀態(tài)下，細(xì)胞于培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)中培養(yǎng)；缺氧狀態(tài)下于三氣培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2、37 ℃、94% N2)中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞感染 分別取如上兩種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎癌細(xì)胞接種于12孔板，10 000 個(gè)/孔，待細(xì)胞50%融合后改置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。向每孔加入完全培養(yǎng)基(含5 mg/L聚凝胺)，再加入慢病毒(含Control shRNA或HIF-1α shRNA或HIF-2α shRNA)10 MOI，8 h后去上清，加入1 mL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot)法測(cè)定蛋白水平 用BCA法測(cè)定細(xì)胞提取的總蛋白濃度，用溴酚藍(lán)緩沖液調(diào)齊濃度，煮沸變性，電泳，濕轉(zhuǎn)，封閉，孵一、二抗，洗滌，用辣根過氧化物酶顯色，化學(xué)發(fā)光拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)/孔，接種于含有載玻片的12孔板，待細(xì)胞50%融合后，置三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別為：對(duì)照組(不加任何藥物)、索拉非尼組(索拉非尼5 μmol/L)、索拉非尼+Control shRNA組(索拉非尼5 μmol/L+Control shRNA 10 MOI)、索拉非尼+HIF-2α shRNA組(索拉非尼5 μmol/L+HIF-2α shRNA 10 MOI)，每組3個(gè)復(fù)孔。24 h后取轉(zhuǎn)染后的上述兩種腎癌細(xì)胞，胰酶消化，洗滌，離去上清，用0.5 mL Annexin V溶液重懸，調(diào)整細(xì)胞質(zhì)量濃度至1×109個(gè)/L，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，避光3 min；加入20 mg/L PI染液10 μL，避光10 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)1.2.4分組的細(xì)胞，按照TUNEL試劑盒步驟操作，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，計(jì)算陽性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼在缺氧環(huán)境下調(diào)控腎癌細(xì)胞HIF-2α、HIF-1α的表達(dá)

OS-RC-2、786-O細(xì)胞在常氧環(huán)境下，HIF-1α和HIF-2α表達(dá)量很低，而在缺氧環(huán)境下表達(dá)明顯上調(diào)；在缺氧條件下，HIF-1α shRNA或HIF-2α shRNA均可以分別降低OS-RC-2、786-O細(xì)胞中HIF-1α或HIF-2α的表達(dá)，與對(duì)照組比較，索拉非尼組能夠使HIF-1α表達(dá)下降，且能夠使HIF-2α蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2 HIF-2α調(diào)控缺氧環(huán)境下索拉非尼促進(jìn)OS-RC-2、786-O細(xì)胞凋亡

缺氧環(huán)境下，與對(duì)照組比較，索拉非尼可明顯增強(qiáng)OS-RC-2細(xì)胞的凋亡(23.52±3.26vs5.32±1.23，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA組與索拉非尼+Control shRNA組相比，細(xì)胞凋亡增加明顯(44.36±2.21vs23.32±3.63，P<0.05)，索拉非尼組與索拉非尼+Control shRNA組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(23.32±3.63vs23.52±3.26，P>0.05)。與對(duì)照組相比，索拉非尼可增強(qiáng)腎癌786-O細(xì)胞凋亡(12.36±3.19vs3.21±1.09，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA組與索拉非尼+Control shRNA組相比，細(xì)胞凋亡增加明顯(33.52±5.23vs12.66±3.69，P<0.05)，索拉非尼組與索拉非尼+Control shRNA組相比，凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12.36±3.19vs12.66±3.69，P>0.05)。TUNEL結(jié)果如下，與對(duì)照組比較，索拉非尼可明顯增強(qiáng)OS-RC-2細(xì)胞的凋亡(21.26±3.19vs1.91±0.60，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA組與索拉非尼+Control shRNA組相比，細(xì)胞凋亡增加明顯(49.23±5.11vs19.91±4.19，P<0.05)，索拉非尼組與索拉非尼+Control shRNA組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20.96±3.19vs19.91.52±4.19，P>0.05)。與對(duì)照組相比，索拉非尼可增強(qiáng)腎癌786-O細(xì)胞凋亡(13.51±3.02vs1.01±0.52，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA組與索拉非尼+Control shRNA組相比，細(xì)胞凋亡增加明顯(57.13±5.23vs13.60±3.62，P<0.05)，索拉非尼組與索拉非尼+Control shRNA組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.50±3.02vs13.60±3.62，P>0.05)(圖2)。

2.3 缺氧環(huán)境下HIF-2α對(duì)腎癌OS-RC-2、786-O細(xì)胞Caspase3蛋白的影響

缺氧環(huán)境下，分別將細(xì)胞用Western blot法檢測(cè)Caspase3蛋白表達(dá)，在OS-RC-2、786-O細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，索拉非尼以及索拉非尼與HIF-2α shRNA聯(lián)用可使Pro-Caspase3表達(dá)下降、Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)升高，與索拉非尼+Control shRNA組相比，索拉非尼+HIF-2α shRNA聯(lián)用組的Pro-Caspase3表達(dá)下降，Cleaved Caspase3表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

3 討論

HIF-1α與HIF-2α蛋白在常氧條件下因泛素化降解而不能穩(wěn)定存在，在腫瘤組織的缺氧環(huán)境下，因HIF-1α與HIF-2α蛋白表達(dá)較高，泛素化降解作用較弱，從而使HIF-1α與HIF-2α蛋白能夠高表達(dá)且穩(wěn)定性存在[8]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了這一觀點(diǎn)。缺氧時(shí)，當(dāng)HIF-1α的表達(dá)低時(shí)則會(huì)代償性使HIF-2α表達(dá)上調(diào)，反之亦然[9]。HIF-1α與HIF-2α是腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下發(fā)生凋亡抵抗的關(guān)鍵蛋白[10]。

索拉非尼治療晚期腎癌患者的原理是通過抑制Ras/Raf激酶活性、PDGF受體、EGFP受體等途徑來抑制新生血管生成及腫瘤細(xì)胞增殖[11]。由于有效率過低，因而探尋索拉非尼的耐藥機(jī)制，是提高索拉非尼在中晚期腎癌療效的關(guān)鍵所在。本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼能夠明顯下調(diào)腎癌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)，代償性升高了影響索拉非尼發(fā)揮其藥物敏感性的關(guān)鍵蛋白HIF-2α的表達(dá)。本研究用shRNA敲減腎癌細(xì)胞中HIF-2α表達(dá)后，實(shí)現(xiàn)對(duì)HIF-1α和HIF-2α雙重抑制，從而使索拉非尼促腎癌細(xì)胞凋亡的活性有了明顯提高，表明HIF-2α和索拉非尼聯(lián)用可以協(xié)同促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，且這種凋亡途徑是通過調(diào)控Caspase3蛋白來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞缺氧環(huán)境下，HIF-2α蛋白是影響索拉非尼藥物敏感性的重要角色，而不是HIF-1α。敲減HIF-2α有可能成為提高索拉非尼聯(lián)合用藥治療中晚期腎癌患者的重要手段。