賀曉龍，王殿振，查 磊，楊宇童

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜北微生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究中心，陜西延安716000；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000）

北蟲(chóng)草最佳組織分離期的篩選

賀曉龍1，2，王殿振1，查 磊1，楊宇童1

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜北微生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究中心，陜西延安716000；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000）

為提高北蟲(chóng)草母種質(zhì)量，促進(jìn)其商業(yè)化生產(chǎn)，采用組織分離法研究北蟲(chóng)草5個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育期（原基期，子實(shí)體生長(zhǎng)15d、30d、45d和60d）組織分離對(duì)母種質(zhì)量的影響。結(jié)果表明：原基期組織分離得到母種的菌絲體生長(zhǎng)速度最快，為3.18mm/d，菌絲體生長(zhǎng)整齊、純白、濃密且轉(zhuǎn)色效果最好，與其他4個(gè)時(shí)期得到母種的菌絲體生長(zhǎng)速度間差異極顯著。北蟲(chóng)草組織分離母種宜選用原基期組織。

北蟲(chóng)草；組織分離；菌絲體生長(zhǎng)速度與長(zhǎng)勢(shì)；轉(zhuǎn)色

北冬蟲(chóng)夏草〔Cordycepsmilitaris（L.）Link〕又稱北蟲(chóng)草、蛹蟲(chóng)草，屬子囊菌門(mén)（Ascomycota）盤(pán)菌亞門(mén)（Pezizomycotina）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麥角菌科（Clavicip itaceae）蟲(chóng)草屬（Cordyceps）。目前，世界上已發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草屬真菌400多種，我國(guó)記錄有100種［1］。北蟲(chóng)草是冬蟲(chóng)夏草的同屬異種真菌，二者的化學(xué)成分和營(yíng)養(yǎng)成分以及藥用功效十分相似［2］。北冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草多糖含量明顯高于天然冬蟲(chóng)夏草，其含量分別為冬蟲(chóng)夏草的29倍、27倍和32倍，而氨基酸含量基本接近，是天然冬蟲(chóng)夏草的理想代用品［3］。20世紀(jì)90年代以來(lái)，有關(guān)北蟲(chóng)草藥化、藥理、毒理和毒性的研究以及安全評(píng)價(jià)證實(shí)人工栽培的北蟲(chóng)草無(wú)毒副作用。其不僅具有滋補(bǔ)強(qiáng)身、補(bǔ)肺益腎、鎮(zhèn)靜、平喘、抗心率失常、抗疲勞、抑制瘍細(xì)胞、治療肺結(jié)核、抗疲勞、抗腫瘤和抑制癌細(xì)胞等特殊功效，而且可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［4］，其功效可與人參、鹿茸相媲美［5］。由于野生北蟲(chóng)草在自然界數(shù)量很少，資源奇缺，采集困難，因此，價(jià)格昂貴而享有“國(guó)寶”之譽(yù)。

北蟲(chóng)草人工栽培馴化已獲得成功且可進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，其生產(chǎn)所用菌種大多采用野生蟲(chóng)草分離得到［6］。李青苗等［7-8］研究表明，組織分離可作為獲得北蟲(chóng)草優(yōu)質(zhì)菌種的有效方法之一。許慶國(guó)［9］研究發(fā)現(xiàn)，選取鮮嫩北蟲(chóng)草子實(shí)體頂端靠尖1～2cm處（不去皮）組織分離獲得的菌種其性狀表現(xiàn)優(yōu)異，遺傳性狀穩(wěn)定一致。楊玉紅等［10］進(jìn)行了有關(guān)北蟲(chóng)草不同部位組織分離和繼代培養(yǎng)研究且篩選出性狀優(yōu)良的菌株。胡中娥等［11］研究發(fā)現(xiàn)，組織分離＋復(fù)壯技術(shù)可明顯提高北冬蟲(chóng)夏草菌種菌絲的生長(zhǎng)活力。目前，有關(guān)北蟲(chóng)草組織分離的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，但有關(guān)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期組織分離母種的研究則未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者采用組織分離方法研究北蟲(chóng)草5個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育期組織分離對(duì)母種質(zhì)量的影響，旨在為提高北蟲(chóng)草人工栽培母種的質(zhì)量，促進(jìn)其商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 北蟲(chóng)草組織 北蟲(chóng)草原基與不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期子實(shí)體，由延安大學(xué)食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑 葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、K2HPO4和MgSO4均為分析純，酵母片和馬鈴薯均為市購(gòu)。

1.1.3 儀器 試驗(yàn)儀器包括高壓蒸汽滅菌鍋、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電冰箱、電子天平、多功能微電腦電磁爐、超凈工作臺(tái)、超純水機(jī)及玻璃儀器氣流烘干器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 1）培養(yǎng)基制備。用馬鈴薯200g＋瓊脂20g＋葡萄糖20g＋蛋白胨5g＋酵母片5g＋K2HPO40.5g＋水1 000mL制備培養(yǎng)基，pH自然。用180mm×18mm的試管分裝培養(yǎng)基，每支試管8mL，加蓋棉塞，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30min，完成后取出擺斜面，冷卻，無(wú)菌檢驗(yàn)后待用。2）北蟲(chóng)草組織的選取。分別選取原基期和子實(shí)體生長(zhǎng)15d、30d、45d、60d等5個(gè)時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育良好且未被污染的蟲(chóng)草組織。具體操作：原基期選取原基較多且分布均勻的栽培瓶；子實(shí)體時(shí)期按生長(zhǎng)時(shí)間選取蟲(chóng)草形態(tài)良好，生長(zhǎng)健壯的子實(shí)體。將選好的栽培瓶放入無(wú)菌操作室內(nèi)待用。

1.2.2 組織分離培養(yǎng) 試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，即，T1，原基期；T2，子實(shí)體生長(zhǎng)15d；T3，子實(shí)體生長(zhǎng)30d；T4，子實(shí)體生長(zhǎng)45d；T5，子實(shí)體生長(zhǎng)60d。參照文獻(xiàn)［12］的方法，在超凈工作臺(tái)酒精燈火焰旁打開(kāi)栽培瓶的封口膜。原基直接用接種鋤挑取1小塊接入到培養(yǎng)基中央，其他時(shí)期的分離材料用無(wú)菌剪刀剪取，用接種鋤接入到培養(yǎng)基上。每個(gè)時(shí)期的蟲(chóng)草分別接9支，23℃恒溫培養(yǎng)。每天定時(shí)觀察，記錄組織塊在培養(yǎng)基上的定植萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)色 參照文獻(xiàn)［13］的方法將培養(yǎng)完成的長(zhǎng)滿菌絲體的試管置于溫度為20℃有散射光照射的環(huán)境中進(jìn)行轉(zhuǎn)色，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，記錄不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色速度，7d后觀察不同時(shí)期的轉(zhuǎn)色率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期北蟲(chóng)草組織分離母種菌絲體的生長(zhǎng)

從表可知：1）長(zhǎng)勢(shì)。T1的母種菌絲體生長(zhǎng)速度較快，菌絲體長(zhǎng)勢(shì)好，整齊、純白、濃密；T2、T3和T4其次，菌絲體長(zhǎng)勢(shì)較好，純白、濃密但不整齊；T5的母種菌絲體生長(zhǎng)速度較慢，長(zhǎng)勢(shì)較差，白，不整齊且較稀疏。方差分析結(jié)果F＝20.045（＞F4，10，0.01＝5.994），表明，處理間長(zhǎng)勢(shì)差異達(dá)極顯著。2）日均生長(zhǎng)速度。不同時(shí)期組織分離母種的菌絲體日均生長(zhǎng)速度依次為T(mén)1（3.177mm/d）＞T2（2.737mm/d）＞T3（2.570mm/d）＞T4（2.373mm/d）＞T5（2.170mm/d）。多重比較表明，T1與其他4個(gè)處理母種菌絲體的生長(zhǎng)速度差異極顯著；T2、T3和T4與T5間差異極顯著，T2和T3與T4間的差異顯著。說(shuō)明，北蟲(chóng)草原基期組織分離的母種菌絲體生長(zhǎng)速度最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，為母種組織分離的最佳時(shí)期。

2.2 不同時(shí)期北蟲(chóng)草組織分離母種菌絲體的轉(zhuǎn)色效果

觀察結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)色7d后，菌絲體轉(zhuǎn)色效果依次為T(mén)1（95%）＞T2（90%）＝T3（90%）＞T4（80%）＞T5（70%）。其中，T1的菌絲體轉(zhuǎn)色效果最好，T2和T3次之，T5的菌絲轉(zhuǎn)色效果最差。表明，原基期的菌絲體轉(zhuǎn)色速度最快，是最適合的母種組織分離時(shí)期。

表 不同時(shí)期北蟲(chóng)草組織分離母種菌絲體的生長(zhǎng)Table Mycelia growth of mother strains ofC.militarisobtained in various stages

3 結(jié)論與討論

北蟲(chóng)草原基期組織分離得到的母種菌絲體生長(zhǎng)速度最快（3.18mm/d），長(zhǎng)勢(shì)最好，轉(zhuǎn)色最快且轉(zhuǎn)色效果最好。因此，原基期是北蟲(chóng)草最佳的母種組織分離時(shí)期。原因可能與北蟲(chóng)草不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌絲體細(xì)胞活力有關(guān)。原基期的菌絲體細(xì)胞分化程度最低，細(xì)胞活力最高。在該時(shí)期進(jìn)行組織分離得到的母種活力及長(zhǎng)勢(shì)最好。而生長(zhǎng)成熟的子實(shí)體其菌絲體細(xì)胞分化程度高，細(xì)胞已經(jīng)老化，細(xì)胞活力下降。所以該時(shí)期的子實(shí)體進(jìn)行組織分離得到的母種活力較低，再生能力很弱，故生長(zhǎng)速度慢，長(zhǎng)勢(shì)及轉(zhuǎn)色效果差，不適合在這個(gè)時(shí)期進(jìn)行組織分離母種。

［1］劉春泉，宋江峰，李大婧，等.北冬蟲(chóng)夏草多糖組分的分離純化及結(jié)構(gòu)研究進(jìn)［J］.食品科學(xué)，2007（1）：370-372.

［2］王銳麗，段鴻斌，殷東林，等.代料栽培蛹蟲(chóng)草營(yíng)養(yǎng)液的優(yōu)化［J］.食用菌，2016（1）：35-36.

［3］秦秀麗，邢 力，尹 銳，等.北冬蟲(chóng)夏草人工培養(yǎng)固體培養(yǎng)基優(yōu)化研究［J］.北方園藝，2013（6）：149-152.

［4］劉 芳，李 帥，高 劍，等.不同培養(yǎng)基配方對(duì)北蟲(chóng)草中蛋白質(zhì)和氨基酸含量的影響［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（12）：15-17.

［5］葉 博.北蟲(chóng)草藥理作用研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（9）：52-54.

［6］張宗豪.不同培養(yǎng)基對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2009，39（4）：6-7.

［7］李青苗，郭俊霞，王曉宇，等.北蟲(chóng)草組織分離子實(shí)體生長(zhǎng)情況的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（15）：3-4.

［8］郭俊霞，李青苗，王曉宇，等.北蟲(chóng)草子實(shí)體組織分離菌絲生長(zhǎng)比較研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015（7）：1759-1760.

［9］許慶國(guó).北蟲(chóng)草子實(shí)體組織分離技術(shù)試驗(yàn)［J］.食用菌，2013（1）：20.

［10］楊玉紅，劉 芳，康宗利，等.北蟲(chóng)草菌種人工分離的研究［J］.中國(guó)食用菌，2012（1）：11-12.

［11］胡中娥，鐘國(guó)祥，沈愛(ài)喜，等.北冬蟲(chóng)夏草組織分離及復(fù)壯菌種的試驗(yàn)研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013（10）：124-125，134.

［12］鎖現(xiàn)民，蔡樹(shù)威，張現(xiàn)法，等.淺談?dòng)枷x(chóng)草栽培菌種制作及鑒定［J］.食用菌，2009（4）：41.

［13］杜雙田，周鋒利，陳德育，等.溫度對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，35（5）：159-162.

（責(zé)任編輯：王 海）

Screening of Optimal Tissue Isolation Period ofCordycepsmilitaris

HE Xiaolong1，2，WANG Dianzhen1，ZHA Lei1，YANG Yutong1
（1.CollegeofLifeSciences/ResearchCenterofMicrobialResourcesDevelopmentandUtilizationinNorthern Shaanxi，Yan’anUniversity，Yan’an716000；2.RegionalBiologicalResourcesConservationandUtilizationin ShaanxiProvinceEngineeringResearchCenter，Yan’an，Shaanxi716000，China）

In order to improve the mother strain quality ofC.militaris，promote the commercial production，tissue isolation method was employed to explore the effects of organization separation in five different growth and development period（primordial stage and fruiting body growth 15d，30d，45dand 60d）on mother strain quality ofC.militaris.Results：Mycelia growth rate of mother strains obtained in primordial stage was the highest，3.18mm/d.The mycelia were of neat growth，pure white color，thick and best coloring effects，the growth speed of which was extremely significantly different with that obtained in the other four stages.The tissue separation ofC.militarisshould be conducted in primordial stage.

Cordycepsmilitaris；tissue isolation；growth rate and growth vigor of mycelium；coloring

S567.3＋5

A

2016-05-05；2016-08-13修回

陜西科技廳協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目“陜北能源化工基地石油廢棄物無(wú)害化生物修復(fù)處理關(guān)鍵技術(shù)研究”（2015XT-34）；陜西省教育廳科研項(xiàng)目“延安地區(qū)北蟲(chóng)草菌種分離與復(fù)壯研究”（15JK1815）；延安大學(xué)2015年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“榆黃蘑液體發(fā)酵條件優(yōu)化”（1450），研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目“北蟲(chóng)草菌種分離與復(fù)壯方法的篩選研究”（2015）

賀曉龍（1982-），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事生物技術(shù)與食用菌研究。E-mail：Xiongyx＠vip.sina.com

1001-3601（2016）09-0389-0089-02