高源

（貴州省食品藥品檢驗所 貴州貴陽 550001）

花紅膠囊微生物限度檢查方法學驗證

高源

（貴州省食品藥品檢驗所 貴州貴陽 550001）

目的 對花紅膠囊微生物限度檢查方法進行方法學驗證。方法 按《中國藥典》（2010版）一部附錄Ⅷ C項下的常規(guī)方法檢查，采用平皿計數(shù)法，分組分別使用5種試驗菌驗證。結果：花紅膠囊中5種試驗菌的回收率均達70%以上。控制菌大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌經方法學驗證可行性強。結論 采用常規(guī)檢查法對花紅膠囊微生物限度檢查，可控制該產品的細菌、霉菌和酵母菌的總數(shù)和控制菌。

花紅膠囊 微生物限度檢查方法驗證

花紅膠囊的處方為紅花 ，桑寄生，伸筋草、烏鞘蛇等。主要用于慢性盆腔炎、附件炎等癥，本產品是口服中成藥膠囊制劑，查詢文獻可知，無此品種的微生物限度檢查方法，本文通過參考中國藥典2010年版一部方法，通過微生物限度方法學的驗證試驗。確定采用常規(guī)法進行霉菌和酵母菌計數(shù)及控制菌驗證。

1 儀器、試藥

1.1 儀器 三洋全自動蒸汽滅菌器、便攜式電子天平、超凈實驗臺。

1.2 試藥 固體培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂，玫瑰紅鈉瓊脂，營養(yǎng)肉湯，膽鹽乳糖增菌液，改良馬丁 。以上5種培養(yǎng)基均來源于中國北京三科科技開發(fā)公司生產。

1.3 供試品 批號為140501，140502，140503花紅膠囊，規(guī)格為0.5g每粒

1.4 菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌種均來源于中國藥品生物制品檢定所

2 試液的制備

按瓶標簽標示方法配置培養(yǎng)基，按藥典規(guī)定方法配置稀釋劑與緩沖液，并按要求滅菌。

3 方法與結果

3.1 菌液制備 在超凈臺中無菌操作，取三種細菌實驗菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱34℃培養(yǎng)24小時后，制成濃菌液，逐級稀釋制成50-100cfu/ml的菌液備用；無菌操作取白色念珠菌，接種于改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱24℃培養(yǎng)24小時，逐級稀釋，得50-100cfu/ml的菌液備用；無菌操作取黑曲霉接種至改良馬丁瓊脂斜面，培養(yǎng)箱24℃培養(yǎng)5天，逐級稀釋，得50-100cfu/ml的菌液備用。

3.2 供試液制備 按《中國藥典》2010年版一部附錄ⅪⅡC微生物限度檢查法，無菌操作取樣品10 g，至100mL的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白緩沖液中，混勻作為供試液

3.3 計數(shù)方法

3.3.1 試驗組 取1：10供試液1mL、0.5mL、0.2mL共三個取樣量級別，毎一取樣量級別平行制備2個平皿為一組，共制備5組，在每一級別的每一組中分別加入五種試驗菌，每皿92CFU，傾注相應培養(yǎng)基，在規(guī)定溫度下培養(yǎng)作回收試驗。

3.3.2 菌液組 取試驗菌分別注入1mL至培養(yǎng)皿中，平行試驗，得到菌液組試驗菌數(shù)。

3.3.3 供試品對照組 取供試液注入培養(yǎng)皿中，平行試驗，得到供試品菌數(shù)。通過實驗結果可見，供試液 取1mL/皿時五種試驗菌的回收率均能達到70%以上，因此該產品微生物限度檢查法細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)擬采用平皿法（1：10供試液 1mL/皿）。

3.4 大腸埃希菌、大腸菌群檢查

花紅膠囊系含藥材原粉的口服制劑，應進行大腸埃希菌、大腸菌群的檢查

3.4.1 供試品組：取本品10g至100mL的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，充分溶解后混勻，靜置3分鐘吸取上清液作為1：10供試液。

3.4.2 試驗組：取供試液10mL與1mL，加入90cfu的大腸埃希菌液，至于100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基與10mL乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，在34℃培養(yǎng)18～24h，按《中國藥典》2010 版控制菌 檢查法檢查。

3.4.3陰性對照 加入同體積pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，同法處理。結果：試驗組檢出試驗菌，陰性菌對照組未檢出，該試驗方法成立。

3.5 沙門菌方法驗證實驗

花紅膠囊組方含有動物原粉，控制菌應進行沙門氏菌的檢查

3.5.1 供試品組：取樣品10g加入200mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內，34℃培養(yǎng)18～24h，取培養(yǎng)物1mL接種于10mL四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，34℃培養(yǎng)18～24h，按《中國藥典》2010 版控制菌（ 沙門菌） 檢查法檢查。

3.5.2 試驗組：取供試液10mL與的大腸埃希菌液（50cfu～100cfu）加入10mL乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，34℃培養(yǎng)24h，按《中國藥典》2010 版控制菌檢查法檢查。

3.5.3陰性對照 加入同體積pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，同法處理。結果：試驗組檢出試驗菌，陰性菌對照組未檢出，試驗方法成立。

4 討論

研究過程中發(fā)現(xiàn)，本品藥物粉末較細，加入稀釋劑后粘稠，所以必須要靜置取上清液，不然會出現(xiàn)堵塞吸管的現(xiàn)象。實驗結果表明，該供試品對五種試驗菌的回收率均高于70%， 控制菌陰性無干擾，陽性可檢出。故本品無抑菌作用。因此，本品可按常規(guī)法測定細菌數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)以及針對控制菌進行控制。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥 科技出版社，2010： 附錄 XIIIC79-84.

［2］劉軍玲.感冒退熱顆粒微生物限度檢查方法學驗證［J］.安徽醫(yī)藥. 2008.12（2）：125.

［3］張亞宇，孔劍鋒，周國璽.復方丹參片微生物限度檢查方法驗證［J］甘肅中醫(yī)學 院學報.2013.1（30）：55.

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