王銳 安曉麗 梁秋波 張道旭 李鄭武

（哈藥集團技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025）

抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽（hCG β-CTP）單克隆抗體制備及初步鑒定

王銳 安曉麗 梁秋波 張道旭 李鄭武

（哈藥集團技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025）

本研究以重組人促紅素-CTP融合蛋白（EPO-CTP）進行真核表達，獲得純品蛋白，免疫小鼠，采用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，獲得1株可穩(wěn)定分泌抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽（hCGβ-CTP）的雜交瘤細胞株，命名為E4。ELISA鑒定結(jié)果表明，單抗的亞型為IgG1，輕鏈為K鏈，腹水效價都在5×10-5以上。從而為驗孕產(chǎn)品特異性的提高和以連接CTP的融合蛋白藥物的研制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

抗人絨毛膜 hCGβ-CTP 單克隆抗體

人絨毛膜促性腺激素（human chorionie gonadotrophin，HCG）是人類受孕后胎盤合體滋養(yǎng)層細胞分泌的維持正常妊娠必需的一種糖蛋白激素。HCG分子含有兩個亞基，分別為α和β亞基，其生物學活性和免疫學特性由β亞基決定。在妊娠早期HCG的濃度迅速增高，監(jiān)測尿中的HCG即可證實妊娠。hCG的β亞基羧基端28殘基組成的28肽是hCG分子所特有的片段，其糖含量高，可以延長體內(nèi)半衰期，現(xiàn)很多蛋白藥物與其連接，以達到長效機制。獲得抗hCGβ羧基末端肽單克隆抗體可以進一步提高驗孕產(chǎn)品檢測的敏感性和特異性，并為避孕疫苗的研制和連有CTP的融合蛋白藥物的分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料

重組人促紅素-CTP融合蛋白：本室提供；胎牛血清，1640培養(yǎng)基，H T，H A T，聚乙二醇：S i g m a公司；鼠源單抗亞類試劑盒：SouthernBiotech；其余生化試劑均為分析純。

2 方法

（1）動物免疫。按照薩姆布魯克J等［1］報道的方法，將重組人促紅素-CTP融合蛋白作為免疫蛋白。以1μg/μL的濃度，對6只7周齡巴比西小鼠進行免疫，每只接種100μL，間隔2周免疫一次，共3次，細胞融合于最后一次免疫后7天進行。（2）ELISA方法的建立。以重組人促紅素-CTP融合蛋白為抗原包被ELISA板，用碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，方陣法確定蛋白最佳包被濃度和陰陽性血清的最佳稀釋倍數(shù)，經(jīng)HRP標記的山羊抗鼠IgG作用，鄰苯二胺底物顯色，判定結(jié)果。判定標準為陽性血清孔的OD492值接近1.0，陰性血清OD492值＜0. 2，P/N≥2.1。（3）細胞融合及篩選?？寡逍r檢測于第3次免疫后7天進行。取脾細胞與Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞，按常規(guī)方法進行融合，HA T篩選融合細胞，采用有限稀釋法對陽性克隆進行篩選，達到1 0 0%陽性者擴大培養(yǎng)，建株保存。（4）單抗亞類鑒定。按SouthernBiotech公司亞類試劑盒說明書用ELISA方法進行檢測。（5）腹水制備。采用體內(nèi)誘生腹水法，按常規(guī)方法制備腹水。用建立的ELISA檢測方法測定單抗腹水效價，以P/N≥2.0的抗體最大稀釋度作為效價終值。（6）抗體識別特異性鑒定。用雜交瘤細胞腹水純化后蛋白做免疫印跡分析，結(jié)果證實本試驗所獲得的單抗能與人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽反應，說明篩選得到的單抗可以特異性識別人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽，進一步證實了所獲得單抗的特異性。（7）雜交瘤細胞穩(wěn)定性分析。對已獲得的1株雜交瘤細胞進行30次傳代，以免疫鼠血清為陽性對照，以空白鼠血清為陰性對照，收集細胞培養(yǎng)上清液并測其效價。

3 結(jié)果

（1）間接ELISA方法結(jié)果。將重組人促紅素-CTP融合蛋白原液，分別以4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml和0.5μg/ml的濃度包被ELISA板，陽性和陰性血清稀釋倍數(shù)為1：100、1：500、1：1000，結(jié)果顯示，抗原濃度在1μg/ml，血清稀釋倍數(shù)為1/1000時，P/N≥2.1。（2）雜交瘤細胞的融合率。本試驗經(jīng)過3次細胞融合，細胞的融合率達到了85.8 %。（3）細胞株的建立。細胞融合后，判定為陽性的雜交瘤細胞經(jīng)3次克隆篩選，獲得能夠穩(wěn)定分泌抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽單抗細胞株，命名為E4。（4）單抗亞類鑒定。經(jīng)單克隆抗體亞類鑒定試劑盒檢測，所獲雜交瘤細胞，均為IgG1型，且都是K輕鏈抗體。（5）單抗腹水效價測定。獲得腹水電泳純度在95%以上，經(jīng)鑒定表明單抗腹水的間接ELSIA效價都在10-5以上。（6）單抗特異性鑒定。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜的蛋白進行單抗孵育。結(jié)果顯示單抗能特異性的識別人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽。（7）細胞分泌抗體穩(wěn)定性分析結(jié)果。雜交瘤細胞株經(jīng)30次傳代，能持續(xù)并穩(wěn)定分泌抗體。

4 討論

本研究以重組人促紅素-CTP融合蛋白為免疫原，免疫巴比西小鼠，獲得一株抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽單抗，命名為E4。經(jīng)鑒定，該株單抗亞類為IgG1，輕鏈為K鏈；雜交瘤細胞連續(xù)傳代30次，其分泌抗體的能力較穩(wěn)定；腹水效價均達到10-5以上；免疫印跡實驗表明，該株單抗能夠特異性識別人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽。目前市場上的驗孕產(chǎn)品，捕獲抗體大多是針對非CTP段抗原表位的抗體，而人的hCGβ與LHβ同源非常高［2］，主要差異就在CTP段，這會給檢測造成假陽性。因此CTP單抗的研制，對于驗孕產(chǎn)品的特異性提高有很大幫助。

目前治療性生物制品的研發(fā)日趨火熱，為了提高蛋白類藥物的半衰期，CTP短肽成為各大藥企研究熱點。鑒于此我們研究并制備了人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽單抗，從而為驗孕產(chǎn)品和長效藥物的研制都提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］薩姆布魯克 J，拉塞爾 DW（黃培堂，等譯）.分子克隆實驗指南［M］.北京：科學出版社，2002，1474-1480.

［2］黃樹峰.綜述 姜衛(wèi)國 審枝.人絨毛膜促性腺激素測定在婦產(chǎn)科的應用（200605）.

S859.2

A

1674-2060（2016）02-0202-01