陳國(guó)棟

（湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東湛江 524022）

同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物、四環(huán)素類(lèi)藥物和沙星類(lèi)藥物的QuEChERS技術(shù)研究

陳國(guó)棟

（湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東湛江 524022）

QuEChERS，即快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效、抗干擾、安全的分析前處理方法之意，目前，關(guān)于QuEChERS技術(shù)仍然主要集中在食品中農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用，在獸藥殘留分析中的應(yīng)用較少，本文將研究水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留同時(shí)檢測(cè)的QuEChERS方法的建立、優(yōu)化。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，本方法選擇乙腈為提取溶劑；無(wú)機(jī)鹽應(yīng)選擇氯化鈉和無(wú)水硫酸鈉；吸附劑應(yīng)選擇psa；提取溶液的ph值應(yīng)該控制在5-6的弱酸性條件下。

QuEChERS 水產(chǎn)品 多獸藥殘留 優(yōu)化

引言

我國(guó)是水產(chǎn)品的生產(chǎn)及出口大國(guó)，出口的水產(chǎn)品被檢出違禁藥物的事件屢有發(fā)生，水產(chǎn)品作為一種高風(fēng)險(xiǎn)食品面臨的形勢(shì)非常嚴(yán)峻。這。我國(guó)是獸藥生產(chǎn)和使用的大國(guó)，尤以化學(xué)合成獸藥為主，食品中獸藥殘留的問(wèn)題日益突出。如何對(duì)食品中的獸藥進(jìn)行快速、有效地檢測(cè)一直是檢驗(yàn)檢疫研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題［1］。

近年來(lái)，隨著氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀、超高效液相色譜、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀［2］等大型檢測(cè)儀器的推廣和普及，使得食品中的獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)研究發(fā)展較快，但制約獸藥殘留檢測(cè)的關(guān)鍵——樣品前處理技術(shù)發(fā)展相對(duì)較慢，成為限制獸藥殘留檢測(cè)一大瓶頸問(wèn)題［3］。

一直以來(lái)，在食品中獸藥殘留的定性與定量分析中，樣品前處理程序約占總分析時(shí)間和精力的70%以上［4］；同時(shí)，樣品前處理技術(shù)的優(yōu)劣也直接影響著整套分析方法的方法回收率、檢測(cè)限、分析成本等。如何在保證較好的方法回收率、檢測(cè)限和分析成本的同時(shí)，提高提取效率、縮短檢測(cè)時(shí)間、做到多種目標(biāo)化合物的共同檢測(cè)，已經(jīng)成為分析檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

1 QuEChERS方法簡(jiǎn)介

QuEChERS即快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效、抗干擾、安全的分析前處理方法之意，由美國(guó)科學(xué)家Anastassiades等人在2003年首次提出［5］，后經(jīng)過(guò)多方面的驗(yàn)證和改進(jìn)，正式提出了QuEChERS方法。該方法是尋找一些高效的提取試劑和凈化處理試劑，通過(guò)簡(jiǎn)單的離心或者過(guò)柱，將污染物與樣品基質(zhì)分離［6］。同時(shí)對(duì)一些含脂肪介質(zhì)的樣品通過(guò)該方法提取和凈化并分析污染物殘留，取得了理想的結(jié)果。QuEChERS前處理方法不僅在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥多殘留物檢測(cè)的樣品預(yù)處理中有廣泛的應(yīng)用， 其也在環(huán)境樣品農(nóng)藥多殘留物檢測(cè)［6］、農(nóng)產(chǎn)品中獸藥檢測(cè)及生物樣品藥物檢測(cè)的預(yù)處理等領(lǐng)域得到更為廣闊的應(yīng)用空間［7］。目前，關(guān)于QuEChERS技術(shù)仍然主要集中在食品中農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用，在獸藥殘留分析中的應(yīng)用較少［8］，我國(guó)作為世界上最大的養(yǎng)殖水產(chǎn)品生產(chǎn)國(guó)，水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留同時(shí)檢測(cè)的QuEChERS方法的建立顯得尤為重要。

2 實(shí)驗(yàn)部分

本實(shí)驗(yàn)以南美白蝦為實(shí)驗(yàn)樣品，U P L C-M S M S為分析儀器，分；兩次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

2.1 主要儀器設(shè)備、耗材、試劑

2.1.1 儀器設(shè)備：電子天平、攪拌器、微量移液槍、超高速攪拌槍、低溫高速離心機(jī)、高速振蕩器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、旋渦混合器、超聲波清洗機(jī)、超高效液質(zhì)聯(lián)用儀［9］。

2.1.2 耗材：50mlPP離心管、15ml PP離心管、100ml茄形瓶、10ml旋口試管、0.2um針式過(guò)濾膜、2ml樣品瓶。

2.1.3 試劑：乙腈、正己烷、檸檬酸三Na·2水合物、檸檬酸二Na· 1.5水合物PSA、無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉、正丙醇、超純水、甲酸

2.2 溶液配制

2.2.1乙腈飽和正己烷：在分液漏斗中900ml正己烷加入100ml乙腈，劇烈振蕩后靜置30min，待分層后廢棄下層，取上層備用；

2.2.2 15%乙腈溶液：150ml乙腈加入850ml超純水，混勻備用；

2.3 樣品及樣品處理

蝦去頭殼后取樣約200克，用攪拌器勻質(zhì)。

2.4 樣品提取

2.4.1 第一次試驗(yàn)，的十二種條件，分別是：

a稱(chēng)取5g樣品三份至50ml PP離心管，分別加入乙腈10ml提取，再分別向三個(gè)樣品中加入NaCl 1g、檸檬酸三Na·2水合物1g和檸檬酸二Na·1.5水合物0.5g的混合物作為緩沖鹽，手搖混合均勻后，分別調(diào)pH值至酸性5-6、中性7-8、堿性9-10。再分別向三份樣品中加入4 g無(wú)水硫酸鎂，在凝固前激烈振蕩（立即手動(dòng)混合），再使用1500rpm高速振蕩5分鐘后，離心3000轉(zhuǎn)/分離心5min。取上清液5ml到加有PSA125mg、無(wú)水硫酸鎂750mg 15mlPP離心管，充分手搖振蕩后3000轉(zhuǎn)/分離心5min ，離心后用0.2μm的濾膜過(guò)濾到試管內(nèi)備用；

b稱(chēng)取5g樣品三份至50ml PP離心管，分別加入乙腈10ml提，再分別向三個(gè)樣品中加入NaCl 2g、檸檬酸三Na·2水合物2g和檸檬酸二Na·1.5水合物1g的混合物作為緩沖鹽，手搖混合均勻后，分別調(diào)pH值至酸性5-6、中性7-8、堿性9-10。再分別向三份樣品中加入4g無(wú)水硫酸鎂，在凝固前激烈振蕩（立即手動(dòng)混合），再使用1500rpm高速振蕩5分鐘后，離心3000轉(zhuǎn)/分離心5min。取上清液5ml到加有PSA125mg、無(wú)水硫酸鎂750mg 15mlPP離心管，充分手搖振蕩后3000轉(zhuǎn)/分離心5min ，離心后用0.2μm的濾膜過(guò)濾到試管內(nèi)備用；

c稱(chēng)取5g樣品三份至50ml PP離心管，分別加入甲醇10ml提取再分別向三個(gè)樣品中加入NaCl 1g、檸檬酸三Na·2水合物1g和檸檬酸二Na·1.5水合物0.5g的混合物作為緩沖鹽，分調(diào)pH值在酸性5-6、中性7-8、堿性9-10提取。再分別向三份樣品中加入4g無(wú)水硫酸鎂，在凝固前激烈振蕩（立即手動(dòng)混合），再使用1500rpm高速振蕩5分鐘后，離心3000轉(zhuǎn)/分離心5min。取上清液5ml到加有PSA125mg、無(wú)水硫酸鎂750mg15mlPP離心管，充分手搖振蕩后3000轉(zhuǎn)/分離心5min ，離心后用0.2μm的濾膜過(guò)濾到試管內(nèi)備用。

d稱(chēng)取5g樣品三份至50ml PP離心管，分別加入甲醇10ml提取再別向三個(gè)樣品中加入NaCl 2g、檸檬酸三Na·2水合物2g和檸檬酸二Na·1.5水合物1g的混合物作為緩沖鹽，分調(diào)pH值在酸性5-6、中性7-8、堿性9-10提取。再分別向三份樣品中加入4g無(wú)水硫酸鎂，在凝固前激烈振蕩，再使用1500rpm高速振蕩5分鐘后，離心3000轉(zhuǎn)/分離心5min。取上清液5ml到加有PSA125mg、無(wú)水硫酸鎂750mg 15 mlPP離心管，充分手搖振蕩后3000轉(zhuǎn)/分離心5min ，離心后用0.2μm的濾膜過(guò)濾到試管內(nèi)備用；

2.4.2 第二次試驗(yàn)的三種條件，分別是：

a稱(chēng)取5g樣品至50ml PP離心管加入10ml乙腈，使用高速攪拌槍攪拌，再4g氯化鈉和10g無(wú)水硫酸鈉的混合物攪拌15～60s，3000轉(zhuǎn)/分離心5min，將全部上層溶液轉(zhuǎn)入50mlPP離心管中，加入0.13g PSA后3000轉(zhuǎn)/分再次離心5min，再取出5ml上清液100ml棕色茄形燒瓶中，加入1ml正丙醇，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干。蒸干后的殘留物中加入2ml 15%乙腈，超聲波振蕩30s，溶解。將溶解液轉(zhuǎn)移入10ml玻璃試管內(nèi)，加入乙腈飽和的正己烷0.5ml，充分混合，靜置。取下層液通過(guò)0.2um過(guò)濾膜過(guò)濾備用；

b稱(chēng)取5g樣品至50ml PP離心管加入10ml乙腈，使用高速攪拌槍攪拌，再10g無(wú)水硫酸鈉攪拌15～60s， 3000轉(zhuǎn)/分離心5min，將全部上層溶液轉(zhuǎn)入50mlPP離心管中，加入0.13g PSA后3000轉(zhuǎn)/分再次離心5min，再取出5ml上清液100ml棕色茄形燒瓶中，加入1ml正丙醇，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干。蒸干后的殘留物中加入2ml 15%乙腈，超聲波振蕩30s，溶解。將溶解液轉(zhuǎn)移入10ml玻璃試管內(nèi)，加入乙腈飽和的正己烷0.5ml，充分混合，靜置。取下層液通過(guò)0.2um過(guò)濾膜過(guò)濾備用；

c稱(chēng)取5g樣品至50ml PP離心管加入10ml乙腈，使用高速攪拌槍攪拌，再4g氯化鈉和10g無(wú)水硫酸鈉混合物攪拌15～60s， 3000轉(zhuǎn)/分離心5min，取出5ml上清液100ml棕色茄形燒瓶中，加入1ml正丙醇，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干。蒸干后的殘留物中加入2ml 15%乙腈，超聲波振蕩30s，溶解。將溶解液轉(zhuǎn)移入10ml玻璃試管內(nèi)，加入乙腈飽和的正己烷0.5ml，充分混合，靜置。取下層液通過(guò)0.2um過(guò)濾膜過(guò)濾備用；

2.5 UPLC-MSMS分析條件：

UPLC用色譜柱： 2.1*100mm，ACQUITY UPLC BEH C18流動(dòng)相：A液：H2O：HCOOH=100：0.05 B液：100%CH3CN流速： 0.25ml/min

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果：a本次實(shí)驗(yàn)在提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)甲醇同樣品中的水分有一定的互溶現(xiàn)象。第二次加入試劑離心過(guò)濾的甲醇溶液有渾濁的現(xiàn)象出現(xiàn)，不利于進(jìn)行儀器分析，基本可以排除使用甲醇進(jìn)行分析；b 本次實(shí)驗(yàn)使用乙腈提取的樣品，由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)蒸干濃縮的過(guò)程，在使用儀器分析數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)雜峰干擾太多，對(duì)實(shí)驗(yàn)的整體數(shù)據(jù)干擾太大；c 在對(duì)比酸堿性的提取條件所得的數(shù)據(jù)看，可以基本可以得出檢測(cè)物質(zhì)在酸性的條件下，提取最好；d 四環(huán)素族類(lèi)在本次實(shí)驗(yàn)中基本是不能提取出來(lái)的；e本次實(shí)驗(yàn)選擇了3種緩沖鹽類(lèi)在2種濃度的條件下的提取，從實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)看，增加鹽離的濃度，反而降低了樣品的回收率；

3.1.2 第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)：一、 在整個(gè)提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用PSA提取后的樣品在加入正己烷進(jìn)行去除色素等雜質(zhì)時(shí)效果不是很好，下層溶液還帶有一點(diǎn)顏色；二、三種提取方法檢出回收率效果，磺胺類(lèi)在使用第c的提取試劑下的回收率相對(duì)最好，大約在70-90%之間。四環(huán)類(lèi)在第b的提取試劑下的回收率相對(duì)最好，大約在30%左右。沙星類(lèi)在第b的提取試劑的回收率相對(duì)做好，大約在70-90%之間；

3.2 綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物、四環(huán)素類(lèi)藥物、氟喹諾酮類(lèi)藥物同時(shí)檢測(cè)的QuEChERS方法應(yīng)選擇乙腈為提取溶劑；無(wú)機(jī)鹽應(yīng)選擇氯化鈉和無(wú)水硫酸鈉；吸附劑應(yīng)選擇psa；提取溶液的ph值應(yīng)該控制在5-6的弱酸性條件下。

4 小結(jié)

4.1 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出在同一的提取條件下基本可以對(duì)四環(huán)素族類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)進(jìn)行提取，這就比傳統(tǒng)檢驗(yàn)使用的分類(lèi)處理方法，更加的快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的檢驗(yàn)分析樣品中的獸藥殘留。

4.2 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)，使用本方法進(jìn)行檢測(cè)回收率都在70-90%之間，完全可以滿足檢驗(yàn)所要求的準(zhǔn)確度。而四環(huán)素類(lèi)，雖然回收率相對(duì)偏低，但是作為一種快速、有效的初篩方法，也是一種實(shí)用性很好的檢驗(yàn)方式。

［1黃忠東，郭福慶，楊潔.高效毛細(xì)管電泳法分離土霉素及其相關(guān)物質(zhì)的方法研究［J］.中國(guó)抗生素雜志.2001，26（3）：184-18.

［2］韋壽蓮，鄧光輝，劉玲，等.高效毛細(xì)管電泳-電導(dǎo)檢測(cè)對(duì)四環(huán)素衍生物分離測(cè)定的研究［J］.分析試驗(yàn)室， 2003， 22（3）： 52-55.

［3］馮世德，王波，曲紅杰.農(nóng)藥殘留分析技術(shù)進(jìn)展概述［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，（3）：27-29.

［4］易軍，李云春，弓振斌.食品中農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理技術(shù)進(jìn)展［J］.化學(xué)進(jìn)展，2002，14（6）：415-424.

［5］劉敏，端裕樹(shù)，宋苑苑，等.分散同相萃取-液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)蔬菜水果中氨基甲酸酯和有機(jī)磷農(nóng)藥［J］.分析化學(xué)，2006，34（7）：941-945.

［6］李莉，江樹(shù)人，潘燦平等.分散固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜方法快速凈化測(cè)定枸杞中12種農(nóng)藥殘留［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，8（4）：371-374.

［7］胡西洲，程運(yùn)斌，胡定金.QuEChERS法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥多殘留分析［J］.中國(guó)測(cè)試技術(shù)，2006，32（3）：132-133.

［8］陳振桂，占春瑞，郭平，等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中13種磺胺類(lèi)藥物殘留的研究［J］.食品科學(xué)， 2007， 28（10）： 448-451.

［9］仉文升，李安良.藥物化學(xué).高等教育出版杜.1999：605-610

TS254.7

A

1674-2060（2016）02-0174-02