賈佳

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

重組H9N2亞型禽流感病毒的構(gòu)建及其在A549細(xì)胞上適應(yīng)性研究

賈佳

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

目的： 利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建表達(dá)GFP并具有感染性的重組H9N2亞型禽流感病毒，并用高劑量和低劑量MOI病毒感染腫瘤細(xì)胞A549，研究其對(duì)A549腫瘤細(xì)胞的作用。方法： 以A/Chicken/Jiangsu/14（H9N2）禽流感病毒為骨架，在NS1和NEP之間插入外源片段GFP。參考8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，在293T和MDCK細(xì)胞上包裝產(chǎn)生重組H9N2病毒。提取尿囊液RNA，PCR鑒定并測(cè)序，檢測(cè)其TCID50。按照MOI 0.1和2.0分別將重組病毒感染不同的細(xì)胞，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果： 應(yīng)用反向遺傳技術(shù)成功獲得了重組病毒，并且發(fā)現(xiàn)病毒可以誘導(dǎo)A549的凋亡。結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)GFP的重組病毒，并且其可以誘導(dǎo)A549的凋亡。

H9N2禽流感病毒 反向遺傳技術(shù) A549

隨著反向遺傳技術(shù)的不斷完善，對(duì)流感病毒的改造和利用成為可能［1］。流感具有強(qiáng)傳染性，將其改造成攜帶外源基因的流感病毒載體，有利于轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞，特別是腫瘤細(xì)胞，為腫瘤基因治療提供新的手段［2，3］本文利用H9N2亞型禽流感病毒為骨架，參考H9N2的反向遺傳質(zhì)粒構(gòu)建方案［4］，構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白GFP，更方便的觀察重組病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。研究了重組病毒在A549細(xì)胞上的生長(zhǎng)情況。

1 材料和方法

1.1 毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞

H9N2流感病毒的8個(gè)基因片段的載體質(zhì)粒以及PHW2000表達(dá)/轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒是由揚(yáng)州大學(xué)傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。PEGFP-C1質(zhì)粒購(gòu)于BD Biosciences 公司。293T和MDCK細(xì)胞用含1 0%胎牛血清的D ME M培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

Platinum TaqDNA Polymerase High Fidelity 是Ivitrogen產(chǎn)品。BsmBI是BioLabs產(chǎn)品。PolyFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Qiagen公司。質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒是Axygen產(chǎn)品，10mL/L雞紅細(xì)胞按常規(guī)方法自行制備。

1.3 病毒轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的構(gòu)建參考Manissamy、 Hoffmann報(bào)道［5，6］以 DNAstar 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增NS1、NEP、PEGFP-C1基因的特異性引物。引物是由南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（PAGE純化）。以PHW2000-NS、PEGFP-C1為模板，PCR擴(kuò)增N S 1、N E P、G F P的目的片段，并用B s m B I酶切目的片段和PHW2000，電泳、回收后，在T4連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化、挑取單個(gè)菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)，小提質(zhì)粒，送南京金斯瑞公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確的質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)后，無(wú)菌提取用于轉(zhuǎn)染。

1.4 病毒拯救

將293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞按照2：1的細(xì)胞量鋪入6孔板中，待細(xì)胞豐度達(dá)70-90%時(shí)用無(wú)抗無(wú)血的DMEM洗2次進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照PolyFectR Transfection Reagent的使用說(shuō)明書(shū)。

1.5 重組病毒的鑒定

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞和上清，接種于9-10日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，每個(gè)樣品接種3個(gè)胚，37℃孵化箱培養(yǎng)96h，收集尿囊液進(jìn)行鑒定：

1）拯救病毒的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)：均按照OIE操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。拯救病毒的尿囊液用1%雞紅細(xì)胞進(jìn)行HA試驗(yàn)，HA陽(yáng)性者用H9、H5和形成以（NDV）陽(yáng)性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)。

2）重組病毒的基因保真性鑒定：取HA和HI陽(yáng)性尿囊液提取RNA，用RT-PCR法對(duì)各個(gè)拯救病毒進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和驗(yàn)證。

3）病毒的繁殖能力測(cè)定：測(cè)定雞胚半數(shù)感染量（EID50）將拯救病毒的尿囊液用滅菌的PBS進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度接種5枚SPF雞胚，每胚0.2ML，用Reed-Muench法計(jì)算。

1.6 重組病毒在A549細(xì)胞上的復(fù)制情況

按照MOI為0.1和2.0 PFU/cell兩個(gè)劑量分別感染1X106cell/ mL 的A549細(xì)胞，37℃吸附1h后，棄去培養(yǎng)基，用10%DMEM補(bǔ)上。48h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況（CPE）。

1.7 細(xì)胞活力分析

按照MOI為0.1和2.0 PFU/cell兩個(gè)劑量分別感染1X106cell/ mL 的A549細(xì)胞，48h內(nèi)每隔8h收集一次上清，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力。即A549（5000/孔）鋪于96孔板，加入上述上清，PBS洗后加入DMEM培養(yǎng)基和50u/孔的MTT，37℃孵育3h。棄液，每孔加200ul異丙醇，室溫1h后，用ELASA讀數(shù)儀測(cè)量在540nm下的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組病毒拯救與鑒定

1）病毒拯救：按8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將構(gòu)建的8質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T與MDCK混合細(xì)胞，獲得重組病毒。HA試驗(yàn)表明拯救病毒尿囊液效價(jià)為28。用H9、H5亞型禽流感病毒血清陽(yáng)性血清對(duì)其進(jìn)行HI試驗(yàn)，結(jié)果僅H9陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性，效價(jià)為25。

2）拯救病毒的保真性鑒定：將拯救的重組病毒尿囊液提取RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增各片段并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示序列結(jié)果一致，NS-GFP已成功構(gòu)建。

3）獲救病毒雞胚半數(shù)致死劑量（EID50）的測(cè)定：參照文獻(xiàn)方法，H9N2亞型流感病毒雞胚半數(shù)感染量（EID50）為10-7/0.2mL。

2.2 重組病毒感染A549后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

A549在高劑量感染后從16h開(kāi)始逐漸增長(zhǎng)，在24h達(dá)到半數(shù)感染量，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞變小變形。細(xì)胞在低劑量病毒感染下沒(méi)有改變。MTT分析顯示A549細(xì)胞在MOI 0.1時(shí)細(xì)胞死亡明顯。

3 討論

溶瘤病毒 （Oncolytic virus ，OV） 是天然或經(jīng)人工改造的能特異性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并最終破壞腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)殺傷作用的一類病毒［7］。流感病毒作為一種新型的溶瘤病毒正在進(jìn)行深入研究中。目前研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的誘導(dǎo)凋亡的作用［8］，如禽流感病毒的NS1蛋白可以通過(guò)PKR介導(dǎo)的干擾素途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且具有一定的靶向性［9］。隨著反向遺傳技術(shù)的發(fā)展和病毒學(xué)的完善，利用基因改造等方法以流感病毒作為載體，攜帶外源基因，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)成為一項(xiàng)新的熱點(diǎn)［10］。本文選擇低致病性的H 9N 2亞型禽流感病毒，通過(guò)反向遺傳技術(shù)構(gòu)建表達(dá)GFP的重組病毒，直接通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度更方便的應(yīng)用于觀察禽流感病毒在腫瘤細(xì)胞上的復(fù)制情況和腫瘤細(xì)胞的死亡情況，為進(jìn)一步研究流感病毒攜帶外源基因用于抗腫瘤研究提供了新思路。

［1］Neumann G， Kawaoka Y： Reverse genetics of influenza virus. Virology 2001， 287（2）：243-250.

［2］李穎婷， 謝劍鋒， 鄭奎城： 流感病毒反向遺傳技術(shù)的研究進(jìn)展.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志 2015.

［3］陳帥帥， 沃恩康， 王怡婷， 郭潮潭： 流感病毒介導(dǎo)的抗腫瘤研究進(jìn)展. 醫(yī)學(xué)研究雜志 2014， 第8期：4-6.

［4］Jing B， Chen-Jun LI， Chen HL： Rescue of H9N2 subtype influenza virus by reverse genetics system. Chinese Journal of Veterinary Science 2011.

［5］Hoffmann E， Krauss S， Perez D， Webby R， Webster RG： Eightplasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine 2002， 20（25-26）：3165-3170.

［6］Manicassamy B， Manicassamy S， Belicha-Villanueva A， Pisanelli G， Pulendran B， Garcia-Sastre A： Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010， 107（25）：11531-11536.

［7］Russell SJ， Peng KW， Bell JC： Oncolytic virotherapy. Nature biotechnology 2012， 30（7）.

［8］Schultz-Cherry S， Dybdahl-Sissoko N， Neumann G， Kawaoka Y，Hinshaw VS： Influenza Virus NS1 Protein Induces Apoptosis in Cultured Cells. Journal of virology 2001， 75（17）：7875-7881.

［9］Engel DA： The influenza virus NS1 protein as a therapeutic target. Antiviral research 2013， 99（3）：409-416.

［10］Murphy A， Westwood JA， Brown LE， Teng MW， Moeller M， Xu Y，Smyth MJ， Hwu P， Darcy PK， Kershaw MH： Antitumor activity of dual-specific T cells and influenza virus. Cancer gene therapy 2007， 14（5）：499-508.

Q2

A

1674-2060（2016）02-0015-02