周志如

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 海南?？?571158）

多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

周志如

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 海南海口 571158）

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)由于具備操作方便、快速和靈敏等優(yōu)勢(shì)，并且能夠同時(shí)擴(kuò)增不同的目的基團(tuán)，在微生物檢測(cè)當(dāng)中受到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。多重PCR技術(shù)的研究對(duì)于高效快速檢測(cè)的意義重大，逐漸成為了當(dāng)下的研究焦點(diǎn)。本文將對(duì)多重PCR技術(shù)的原理作出分析，并探討其在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用、問(wèn)題及改進(jìn)方法。

多重PCR技術(shù) 食品微生物檢測(cè) 應(yīng)用進(jìn)展

當(dāng)前的食品行業(yè)中存在許多危害食品品質(zhì)與人類健康的有害微生物，必須通過(guò)敏感、快速、有效的檢測(cè)手段來(lái)及時(shí)發(fā)現(xiàn)、控制致病菌，以降低其危害。多重PCR技術(shù)突破了傳統(tǒng)檢測(cè)手段用時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣的局限，在微生物致病菌檢測(cè)方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。

1　食品微生物的檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)主要有培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法，其中培養(yǎng)法需歷經(jīng)贈(zèng)菌或前增菌、分離、培養(yǎng)和生化、血清學(xué)鑒定等多個(gè)繁瑣流程，十分的耗時(shí)耗力。而具有高敏感度和特異性的免疫學(xué)方法極易受復(fù)雜的微生物血清型影響，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性狀況，檢測(cè)結(jié)果不夠精確。隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，因其操作快捷、成本低廉且特異性和靈敏性強(qiáng)，在食品微生物檢測(cè)中受到了越來(lái)越多的青睞。

2　多重PCR技術(shù)及原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）指的是單鏈DNA模版在體外條件和DNA聚合酶作用下產(chǎn)生DNA片段特異性擴(kuò)增的技術(shù)，經(jīng)歷變性-退火-延伸流程。首先把雙鏈DNA所熱變形成的單鏈DNA靶序列與人工合成引物相結(jié)合，引物受DNA聚合酶作用沿DNA單鏈由5′末端延伸至3′末端并合成雙鏈，使其作為模版在聚合酶反應(yīng)下又形成新的DNA雙鏈，反復(fù)循環(huán)。多重PCR是將兩對(duì)及以上引物加入同一個(gè)反應(yīng)體系中，擴(kuò)增出多個(gè)DNA序列或目的基因。

3　微生物檢測(cè)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用

（1）應(yīng)用于食品病原微生物的檢測(cè)。主要包括：①沙門氏菌。沙門氏菌易因食品成分干擾或食品加工而損傷，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。多重PCR能夠?qū)ι抽T氏菌血清型、突變狀況進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，提升沙門氏菌檢測(cè)率。目前屬特異性引物基因hilA、hns、fimA等與血清型特異性引物基因、血清群特異性引物基因是檢測(cè)沙門氏菌的主要靶基因；②金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌能夠繁殖生成引發(fā)食物中毒的腸毒素SE，廣泛存在于生肉、發(fā)酵肉類和蔬菜當(dāng)中，其相關(guān)檢測(cè)基因包含sea、seb等基因；③腸出血性大腸桿菌。大腸桿菌具有十分相似的產(chǎn)毒素，檢測(cè)時(shí)以緊密素基因eae、鞭毛基因fliCH7等作為目的基因。

（2）應(yīng)用于食品非致病菌的檢測(cè)。乳酸菌對(duì)病菌生長(zhǎng)具有很好的抑制作用，但也常預(yù)示食物的腐敗。食品真空包裝中往往存在含量低卻可繁殖生長(zhǎng)的乳酸菌，多重PVR檢測(cè)可判斷真空包裝食品的腐敗情況。

（3）應(yīng)用于食品相關(guān)環(huán)境微生物的檢測(cè)。外界環(huán)境當(dāng)中廣泛分布著不動(dòng)桿菌和導(dǎo)致醫(yī)院感染的鮑氏不動(dòng)桿菌，以碳青霉烯類耐藥株增加為主要特性的多重耐藥鮑氏桿菌增加給食品安全帶來(lái)了嚴(yán)重威脅，另外，以寄生曲霉為主要病原的黃曲霉中的毒素可致癌。相關(guān)研究顯示，多重PCR技術(shù)在不動(dòng)桿菌、黃曲霉等的檢測(cè)上具有很高的準(zhǔn)確度。

4　微生物檢測(cè)中多重PCR技術(shù)存在的問(wèn)題與改進(jìn)

（1）問(wèn)題。在應(yīng)用食品微生物的多重PCR檢測(cè)技術(shù)時(shí)，多對(duì)引物可能相互抑制并結(jié)合非靶序列出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。受到食品復(fù)雜成分的感染以及微生物含量低的影響，含PCR抑制成分的樣品會(huì)降低檢測(cè)靈敏度，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，不利于多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的普及。

（2）很多學(xué)者為了實(shí)現(xiàn)最佳多重PCR體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，采取了差速離心、免疫磁珠吸附等技術(shù)來(lái)對(duì)樣品前處理效果做出提高，降低了抑制因子的作用。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠定量拷貝數(shù)并免除后處理，具有準(zhǔn)確、特異和高效的優(yōu)勢(shì)，但設(shè)備成本高，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果可能受引物探針含量、外緣DNA等的干擾，在樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)化和檢測(cè)成本降低方面還有待改進(jìn)。結(jié)合DGGE（變性梯度凝膠電泳）能夠?qū)Σ煌瑝A基DNA片段混合物進(jìn)行分離，通過(guò)條帶數(shù)量和明暗程度反映微生物狀況，操作簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確率高，與此同時(shí)因可分析樣品容量較小，故目前僅使用在一些小DNA片段中，其圖譜條帶會(huì)在樣品制備時(shí)發(fā)生改變。

5　應(yīng)用進(jìn)展

多重PCR檢測(cè)技術(shù)效率高、速度塊且特異性好，在食品病原微生物、環(huán)境微生物與非致病微生物的檢測(cè)中意義重大，具有十分廣闊的發(fā)展前景。多重PCR當(dāng)前還面臨著檢測(cè)靈敏度不高、易受抑制因子感染等情況，當(dāng)前的改進(jìn)技術(shù)在一定程度上減少了檢測(cè)的時(shí)間與成本，但同時(shí)也存在諸多問(wèn)題。未來(lái)應(yīng)當(dāng)以樣品前處理技術(shù)的改進(jìn)和印制因子干擾的消除為研究重點(diǎn)，進(jìn)一步提升多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)當(dāng)中的有效性與可行性。

［1］柳洪芳，宋慧.PCR及其改進(jìn)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2012，01：34-36.

［2］王華，劉斌.PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2010，02：63-67.

［3］吳海華.多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)在食品致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代食品，2015，17：43-45.

TS207

A

1674-2060（2016）05-0097-01

周志如（1993—），女，海南東方，海南師范大學(xué)2012級(jí)本科生， 研究方向：生物技術(shù)。