趙群

（皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院 安徽蕪湖 241000）

分子親緣地理學(xué)及遺傳標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

趙群

（皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院 安徽蕪湖 241000）

本文論述了分子親緣地理學(xué)的產(chǎn)生和發(fā)展過(guò)程，以及國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，同時(shí)對(duì)遺傳標(biāo)記特別是線粒體DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)闡述。

分子親緣地理學(xué) 遺傳標(biāo)記技術(shù) 線粒體DNA

1 引言

1908年和1909年,英國(guó)數(shù)學(xué)家哈迪（Hardy）和德國(guó)醫(yī)學(xué)家溫伯格（Weinberg）分別提出在一個(gè)隨機(jī)交配的種群中,若不發(fā)生突變、遷移等因素,在經(jīng)過(guò)傳代后初始基因或基因型頻率則始終恒定不變。在群體遺傳學(xué)研究的初期,由于研究手段的限制,人們沒(méi)有辦法探測(cè)長(zhǎng)期進(jìn)化后群體的遺傳變化。隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用于群體遺傳學(xué),可以利用大分子序列,比如DNA 序列變異來(lái)進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。

2 分子親緣地理學(xué)研究

2.1 親緣地理學(xué)

親緣地理學(xué),又稱為系統(tǒng)發(fā)育生物地理學(xué),是研究親緣關(guān)系相近的物種及種內(nèi)不同種群形成現(xiàn)有地理分布格局的歷史原因和演化過(guò)程的一門學(xué)科。親緣地理學(xué)是生物地理學(xué)的一個(gè)分支,在解釋現(xiàn)有種群分布狀況的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究種群分布的原因,追溯其進(jìn)化歷程,分析種群在時(shí)空上的發(fā)展變化,重建生物區(qū)系的歷史。它主要偏重于對(duì)近緣物種或種內(nèi)的研究,在種內(nèi)水平上描述種群的系統(tǒng)地理格局,進(jìn)而追溯其形成原因,對(duì)物種擴(kuò)散和遷移等微進(jìn)化歷史等進(jìn)行了有效的推測(cè)。

2.2 分子親緣地理學(xué)

由于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及種群遺傳學(xué)等方法和原理的運(yùn)用,使親緣地理學(xué)可以進(jìn)一步從分子水平上描述種群地理格局的形成過(guò)程,探討種群分化的歷史,進(jìn)而推測(cè)種群現(xiàn)有分布格局形成的原因。分子親緣地理學(xué)是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)在分子水平上,研究種群內(nèi)部地理格局形成的相關(guān)原因。

3 遺傳標(biāo)記技術(shù)

3.1 遺傳標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

在分子親緣地理學(xué)的研究的過(guò)程中,離不開(kāi)遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記是指所應(yīng)用的區(qū)別不同個(gè)體或種群,并且能穩(wěn)定地遺傳的標(biāo)記物。伴隨生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)不斷發(fā)展與完善,遺傳標(biāo)記的應(yīng)用與研究也越來(lái)越成熟,在發(fā)展過(guò)程中,依次出現(xiàn)4種主要類型的遺傳標(biāo)記,它們分別是形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記。

3.2 遺傳標(biāo)記的類型

3.2.1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是指在基因表型中可進(jìn)行識(shí)別與目的性狀緊密相關(guān)的等位基因突變體。其主要包括質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀,簡(jiǎn)單而直觀,目前仍然是研究很多物種的分類和起源分化關(guān)系的基礎(chǔ)。但形態(tài)學(xué)標(biāo)記的數(shù)量很少,變異較小,如孟德?tīng)栐谘芯糠蛛x規(guī)律時(shí)所用的性狀只有兩種變異類型,不能隨機(jī)代表生物體的遺傳組成,且生物的表型特征是遺傳和環(huán)境相互作用的結(jié)果,不能直接反映真實(shí)的遺傳變異情況,所以形態(tài)學(xué)標(biāo)記并不完善。

3.2.2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

染色體組型的分析對(duì)于遺傳多樣性的研究具有重要意義。通過(guò)對(duì)各個(gè)分裂期的染色體數(shù)目和一系列形態(tài)學(xué)參數(shù)研究,根據(jù)染色體特征分析可獲取相應(yīng)的染色體組型。但由于染色體組行的差異型,可以用染色體組型作為形態(tài)學(xué)標(biāo)記來(lái)研究生物的遺傳多樣性。

3.2.3 生物化學(xué)標(biāo)記

在凝膠電泳技術(shù)產(chǎn)生和發(fā)展的過(guò)程中,生物化學(xué)遺傳標(biāo)記技術(shù)也迅速發(fā)展起來(lái),通過(guò)生物化學(xué)標(biāo)記,把對(duì)遺傳多樣性的研究從宏觀深入到分子水平,并廣泛用于種群遺傳、雜交育種等各方面的研究。其中的同工酶電泳技術(shù)可以比較不同物種間基因表達(dá)產(chǎn)物的異同,并以此提示基因序列和功能差異。

3.2.4 DNA分子標(biāo)記

隨著分子生物學(xué)和分子克隆技術(shù)的完善和發(fā)展,可以利用生物DNA編碼區(qū)及非編碼區(qū)作為遺傳標(biāo)記,這種遺傳標(biāo)記稱為DNA分子標(biāo)記。DNA分子標(biāo)記是DNA水平上遺傳變異的直接反應(yīng),其本質(zhì)是反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段。在DNA分子中,由于堿基的缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長(zhǎng)短和排列不同的重復(fù)序列等而產(chǎn)生多態(tài)性,通過(guò)不同的分子標(biāo)記就可以檢測(cè)出這些多態(tài)性。

3.2.4.1 以分子雜交技術(shù)和電泳技術(shù)為核心的分子標(biāo)記

（1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

主要是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行處理切割,經(jīng)酶切后DNA會(huì)形成特定大小的DNA片段,根據(jù)不同生物個(gè)體所產(chǎn)生的DNA片段的大小差異而構(gòu)成其多態(tài)性。對(duì)于小分子DNA,如線粒體基因,可將其DNA樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理后形成不同長(zhǎng)度的片段,然后把處理后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離,由于電泳遷移率不同便會(huì)在凝膠上形成連續(xù)的譜帶,不同植物個(gè)體來(lái)源的DNA 可形成不同的譜帶,從而表現(xiàn)出多態(tài)性。

（2）DNA指紋識(shí)別技術(shù)

是一種在單一實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)出大量DNA位點(diǎn)差異性的分子標(biāo)記技術(shù)。在研究人的基因組文庫(kù)時(shí),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)DNA序列高變區(qū),這類高變區(qū)在真核生物基因組中普遍存在,被稱為小衛(wèi)星。小衛(wèi)星序列的結(jié)構(gòu)是由一較短的重復(fù)單位首尾相接、多次重復(fù)而成。由核心序列串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成的小衛(wèi)星DNA 探針,可以同時(shí)與眾多的基因組的酶切DNA片段進(jìn)行Southern雜交,得到含有多條圖帶的具有個(gè)體特異性的DNA雜交圖譜。

3.2.4.2 以電泳技術(shù)和PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記

（1）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

隨機(jī)引物擴(kuò)增建立在PCR基礎(chǔ)上的尋找多態(tài)性DNA片段的分子標(biāo)記技術(shù)。它利用一系列不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸為引物,對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

（2）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

是由Vos發(fā)明的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù),是一種選擇性地?cái)U(kuò)增限制性片段的方法,結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和RAPD的靈敏性。在進(jìn)行AFLP實(shí)驗(yàn)時(shí),先用核酸內(nèi)切酶酶解基因DNA,再將接頭接到限制性片段的兩端,形成帶有接頭的特異性片段,然后用專用引物擴(kuò)增這個(gè)特異性的片段。

（3）微衛(wèi)星DNA標(biāo)記

進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記時(shí),首先要構(gòu)建基因組文庫(kù),根據(jù)要得到的微衛(wèi)星的序列類型,設(shè)計(jì)合成寡核苷酸探針,微衛(wèi)星序列的獲取主要通過(guò)重組克隆菌落原位雜交以及鑒定陽(yáng)性克?。缓笸ㄟ^(guò)鑒別微衛(wèi)星序列的轉(zhuǎn)移性而合成相關(guān)的細(xì)胞引物,以待分析的核DNA為模板進(jìn)行PCR；最后對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),可通過(guò)放射自顯影和銀染法來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

（4）簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間

是近年來(lái)在物種的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)、物種形成和種質(zhì)鑒定等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù),該技術(shù)直接對(duì)其基因組進(jìn)行多態(tài)性分析,沒(méi)有種屬限制,不需要DNA 探針,不受環(huán)境和生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響,不存在表達(dá)與否的問(wèn)題,具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。

（5）單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸的多態(tài)性實(shí)在基因組DNA研究的基礎(chǔ)上,分析特定核苷酸誘發(fā)DNA序列變異的多態(tài)性,其中核苷酸轉(zhuǎn)換、顛倒、插入或缺失是常見(jiàn)的DNA序列變異,其中至少有一種等位基因在群體中的突變頻率不小于1%。SNP只有兩種類型,即雙等位基因。所以,在對(duì)已知突變位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)只需對(duì)SNP進(jìn)行兩種不同類型堿基的確認(rèn)分析即可,不必對(duì)DNA片段進(jìn)行全序列測(cè)定,有利于發(fā)展自動(dòng)化檢測(cè)。SNP具有在個(gè)體中的多態(tài)信息量比SSR標(biāo)記的多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。

3.2.4.3 以DNA直接測(cè)序技術(shù)為核心的分子標(biāo)記

就是直接檢測(cè)基因組DNA的核苷酸排列順序,因此可以直觀地反映遺傳的本質(zhì)。DNA序列分析一般只適用于對(duì)較小的DNA片段或基因進(jìn)行比較分析。可利用PCR技術(shù)先直接從總的DNA中擴(kuò)增出大量的目的DNA片段或目的基因,再對(duì)其進(jìn)行測(cè)序,進(jìn)而分析其遺傳多樣性。

3.3 線粒體DNA

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)為細(xì)胞活動(dòng)提供能量的重要細(xì)胞器,是正常生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化的重要場(chǎng)所。線粒體DNA作為細(xì)胞內(nèi)核外唯一存在的遺傳物質(zhì),與核DNA相比,具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速度快、無(wú)組織特異性等特點(diǎn),是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的復(fù)制單位。線粒體基因組是研究DNA結(jié)構(gòu)與復(fù)制的比較好的模型,也是研究真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成合適的模型系統(tǒng)。

3.3.1 動(dòng)物線粒體DNA概述

3.3.1.1 動(dòng)物線粒體DNA的結(jié)構(gòu)特征

動(dòng)物線粒體DNA是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈超螺旋分子,外圈是它的重鏈（H）,內(nèi)圈為輕鏈（L）。

3.3.1.2動(dòng)物線粒體DNA的遺傳特點(diǎn)

（1）無(wú)組織特異性（2）母系遺傳（3）進(jìn)化速度快

3.3.2 動(dòng)物線粒體DNA的多態(tài)性研究

線粒體DNA的多態(tài)性是指不同群體間或群體內(nèi),線粒體DNA表現(xiàn)出的位點(diǎn)變異和序列長(zhǎng)度變異。不同種、群間,群體內(nèi)以及個(gè)體內(nèi), 線粒體DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)都不完全相同,其存在種間及種內(nèi)多態(tài)性,線粒體DNA的這個(gè)特性已被廣泛地運(yùn)用。

3.3.2.1 動(dòng)物線粒體DNA多態(tài)性的研究方法

3.3.2.1.1 測(cè)序法

是一種無(wú)需提取線粒體DNA的檢測(cè)手段,按常規(guī)方法提取基因組DNA,設(shè)計(jì)引物對(duì)目的DNA片斷擴(kuò)增、純化,進(jìn)行序列測(cè)定,比較不同物種或個(gè)體間的相關(guān)序列,以探求它們之間的進(jìn)化關(guān)系,這種方法可獲得大量直接、可靠的數(shù)據(jù),但受技術(shù)條件和經(jīng)費(fèi)限制,不適合大群體和大樣本的遺傳和進(jìn)化研究。

3.3.2.1.2 限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析法

指利用限制性內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行序列的間接比較的方法。它檢測(cè)的是線粒體DNA的隨機(jī)序列,其優(yōu)點(diǎn)是快速、經(jīng)濟(jì),具有一定的精確度,尤其適用于大群體、大樣本的遺傳進(jìn)化研究。另外,PCR技術(shù)的應(yīng)用可大大減少樣品的用量線粒體DNA。線粒體DNA多態(tài)分析獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)處理都可轉(zhuǎn)換成序列分歧度或遺傳距離,便于進(jìn)行結(jié)果分析。這也是線粒體DNA多態(tài)性研究中使用最多的方法。

3.3.2.2動(dòng)物線粒體DNA多態(tài)性研究領(lǐng)域3.3.2.2.1動(dòng)物線粒體DNA的種間多態(tài)性

研究表明線粒體DNA的限制性圖譜具有一定的種族特征。動(dòng)物研究中牛與豬的線粒體DNA經(jīng)限制酶消化,可分別產(chǎn)生3個(gè)或2個(gè)限制性片段,而牛、山羊和綿羊均屬于洞角科動(dòng)物,但目前動(dòng)物研究顯示5種限制性酶之間幾乎沒(méi)有相同的限制性圖譜,并且在各種酶切割位點(diǎn)數(shù)相同的情況下,限制性片段也存在較大的差異。

3.3.2.2.2動(dòng)物線粒體DNA的種內(nèi)多態(tài)性

目前在海洋生物、爬行類動(dòng)物以及兩棲類動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)線粒體DNA具有多態(tài)性,并且在長(zhǎng)度上易發(fā)生明顯的突變?nèi)缌€鞭尾晰中一個(gè)種群的線粒體DNA比另一個(gè)種群的長(zhǎng)1200個(gè)堿基對(duì),弓鰭魚(yú)的線粒體DNA大小差異在16000-16900個(gè)堿基對(duì)之間。

3.3.2.2.3個(gè)體內(nèi)線粒體DNA的多態(tài)性

有關(guān)研究表明動(dòng)物單體缺乏線粒體DNA的雜合性,并且單一個(gè)體器官組織均可獲取相同的限制性圖譜。雖然偶然狀態(tài)下可檢出線粒體DNA雜合性,但這與雜合的細(xì)胞質(zhì)以及不同組織線粒體DNA的突變密切相關(guān),這類線粒體DNA多態(tài)性的研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及人體研究已證實(shí)。

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A

1674-2060（2016）03-0297-02

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2013B329）