李 峰， 葉向東， 連學(xué)雄， 馮宇鵬

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科， 廣東 廣州 511447)

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Th17T淋巴細胞浸潤及相關(guān)細胞因子在免疫性前列腺炎組織中的表達水平

李 峰， 葉向東， 連學(xué)雄， 馮宇鵬

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科， 廣東 廣州 511447)

【摘 要】目的:分析Th17T淋巴細胞浸潤及相關(guān)細胞因子在免疫性前列腺炎組織中的表達水平。方法:將60只小鼠分為2組，研究組和對照組，造模成功后，取前列腺組織，分別進行免疫組化和PCR檢測Th17T淋巴細胞浸潤及其相關(guān)細胞因子表達情況。結(jié)果:前列腺炎組小鼠前列腺組織中CD4+，CD8+，IL-17+T淋巴細胞計數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)。前列腺炎組小鼠前列腺組織中IL-17、IL-23p19、IL-23p40 mRNA的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)論:免疫性前列腺炎組織Th17T淋巴細胞浸潤及其相關(guān)細胞因子表達顯著升高。

【關(guān)鍵詞】免疫性前列腺炎組織； Th17 T淋巴細胞； 細胞因子； 白介素17

慢性前列腺炎幾乎在所有年齡組的男性均可發(fā)病，并且以中青年為主?；颊呖杀憩F(xiàn)為疼痛、性功能障礙、排尿困難等，治療困難，遷延難愈。既往的而研究顯示，在自身免疫性慢性前列腺炎動物模型的前列腺組織中存在淋巴細胞浸潤，并且以Th1輔助型T淋巴細胞為主[1]。Th細胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用，Thl7輔助性T淋巴細胞以分泌白細胞介素IL-17為主，與多種自身免疫疾病有關(guān)，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等[2，3]。本研究其與免疫性前列腺炎的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要的實驗材料:潔級小鼠60只，隨機分為兩組，每組各30只。一組造免疫性前列腺炎模型，為研究組，一組為對照組。造模方法:采用Wistar大鼠前列腺組織蛋白提純液為免疫原，水合氯醛腹腔注射麻醉，研究組小鼠每只多點皮下注射濃度為2mg/ mL的列腺組織蛋白提純液0.5mL。免疫后60d，將研究組和對照組各分為兩個亞組，其中1個亞組用于RT-PCR檢測，一個亞組用于免疫組織化學(xué)檢測。30只前列腺炎模型小鼠，前列腺炎Ⅰ級8只，Ⅱ級18只，Ⅲ級4只。處死小鼠后取前列腺組織凍存?zhèn)溆?。主要實驗材?大鼠抗小鼠IL-17一抗，大鼠抗小鼠CD4一抗，大鼠抗小鼠CD8一抗。動物組織總RNA提取盒，One step SYBR prime scriptTM RT-PCR kit。引物序列由大連寶生物工程有限公司合成，包括IL-17A引物序列，IL23 19引物序列，IL23p40引物序列，β-actin引物序。

1.2 Th17輔助性T淋巴細胞浸潤情況:取凍存的小鼠前列腺組織，切為5μm片，貼片，甲醛固定，行免疫組化檢測。陽性細胞為淋巴細胞漿/細胞膜有棕黃色著色。每個載玻片選5個高倍視野，計算陽性細胞數(shù)，計算平均值。觀察包括CD4+細胞，CD8+細胞以及IL -17+T淋巴細胞。

1.3 Th17淋巴細胞相關(guān)細胞因子表達情況:取凍存的小鼠前列腺組織，提取總RNA，采用RT-PCR方法檢測前列腺組織中相關(guān)因子IL-17，IL-23p19，IL-23p40的mRNA表達，計算相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件包進行統(tǒng)計與分析，各組數(shù)據(jù)用(均數(shù)±方差)表示，組間比較使用t檢驗，P<0.05表明有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05表明有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠前列腺組織內(nèi)CD4+，CD8+，IL-17+T淋巴細胞浸潤情況:前列腺炎組小鼠前列腺組織中CD4+，CD8+，IL-17+T淋巴細胞計數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組小鼠前列腺組織內(nèi)CD4+ CD8+ IL-17+T淋巴細胞浸潤情況

2.2 兩組前列腺組織內(nèi)IL-17、IL-23p19、IL-23p40 mRNA的表達情況:前列腺炎組小鼠前列腺組織中IL -17、IL-23p19、IL-23p40 mRNA的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組前列腺組織內(nèi)IL-17 IL-23p19 IL-23p40 mRNA的表達情況

3 討 論

非細菌性前列腺炎是有免疫、炎癥、神經(jīng)內(nèi)分泌等參與的復(fù)雜的病理變化，可由多種原因不誘因?qū)е?，主要表現(xiàn)為尿道刺激癥狀以及慢性盆腔疼痛等，患者常常有精神心理癥狀。其病因?qū)W十分復(fù)雜。非細菌性前列腺炎常規(guī)的細菌檢查未見病原體分離，但學(xué)者普遍認為，其仍可能與某些病原體有關(guān)，例如L型變形菌、厭氧菌、沙眼衣原體、納米細菌、支原體[4~6]。尿道括約肌因一些因素導(dǎo)致過度收縮，使膀胱出口發(fā)生梗阻，導(dǎo)致殘余尿，殘余尿發(fā)生尿液反流至前列腺，一方面反流的尿液直接刺激前列腺，誘發(fā)無菌性化學(xué)前列腺炎，一方面，病原也也會隨反流的尿液進入前列腺。前列腺炎經(jīng)久不愈，可引起患者發(fā)生精神心理改變以及人格特征發(fā)生改變。前列腺痛可導(dǎo)致患者發(fā)生心率、血壓波動，這說明自主神經(jīng)反應(yīng)可能參與其中。研究顯示在Ⅲ型前列腺炎的發(fā)展過程中免疫因素發(fā)揮了重要作用，患者的前列腺液中細胞因子水平發(fā)生變化，例如IL-6、IL-2、IL-10、IL-8、TNF-α、MCP-1等，并且研究顯示IL-10的水平與患者疼痛癥狀具有正向相關(guān)的關(guān)系，并且采用免疫抑制劑治療具有一定的療效。正常情況下氧自由基在機體內(nèi)的產(chǎn)生/清除保持平衡，而前列腺炎患者氧自由基生成過多，清除下降，導(dǎo)致機體抗氧化應(yīng)激能力下降，氧化應(yīng)激產(chǎn)物、副產(chǎn)物增加，這也是非細菌性前列腺炎發(fā)病機制之一，前列腺按摩液中存在中性粒細胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞等，但未發(fā)現(xiàn)細菌感染情況[7]。在沒有細菌感染的情況下，前列腺液、精液中的細胞因子表達增高，這說明有活動性炎癥過程存在。研究顯示Th1細胞調(diào)節(jié)的抗原特異性免疫反應(yīng)參與了前列腺炎的發(fā)生和發(fā)展。前列腺炎患者的前列腺組織內(nèi)總IgA、IgG升高，前列腺外周帶IgM沉積增加。對慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者的精漿進行特異性回憶性增殖反應(yīng)研究，10例慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者中3例呈陽性，而15例非慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者中無陽性患者，這證明了慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征自身免疫學(xué)說[8]:慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征前列腺組織中針對前列腺相關(guān)抗原的IgG滴度升高[9]；65%的慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者T細胞自身或異體精漿抗原刺激反應(yīng)呈陽性，而只有15%的非慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者呈陽性；34%的非慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征出現(xiàn)針對前列腺抗原的細胞免疫反應(yīng)。Thl細胞調(diào)節(jié)的抗原特異性免疫反應(yīng)參與了非慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征。另外，精漿富含前列腺液，并且可檢測出TNF-α等細胞因子，提示精漿內(nèi)存在針對前列腺的特異性免疫反應(yīng)。慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者存在低IL-10基因型[10]。對慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征的體液免疫進行研究，結(jié)果顯示前列腺組織內(nèi)的IgG、IgA水平升高，在前列腺外周帶IgM沉積增加[11]，針對前列腺的特異性抗體在慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者精漿和血漿中被檢測到。有細胞免疫參與了慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征的發(fā)病，但是并沒有檢測到針對前列腺抗原的特異性抗體。研究發(fā)現(xiàn)細胞免疫與大鼠EAP有關(guān)，但是未發(fā)現(xiàn)體液免疫與其有關(guān)[12]；33%慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征的患者進行病理學(xué)檢測結(jié)果顯示前列腺組織存在白細胞；對慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者的前列腺組織進行免疫組化檢測，結(jié)果顯示胞毒性T淋巴細胞是主要的腺泡內(nèi)浸潤的T細胞。但是研究顯示并不是所有的慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者均會發(fā)生自身免疫反應(yīng)。慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者群體是一個非均質(zhì)群體，患者可能病因不同，因此并不僅僅與某一發(fā)病因素有關(guān)。研究顯示類風(fēng)濕因子、抗核抗體、紅細胞沉降率、抗甲狀腺抗體、CRP等與慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征之間無明顯的相關(guān)性。

目前學(xué)界認為多種因素與慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征的發(fā)病有關(guān)。國內(nèi)外均有運用免疫方法制作免疫性前列腺炎動物模型的報道，C57BL/6dx鼠的成炎率較高，在免疫后7d前列腺組織內(nèi)就有炎癥細胞浸潤，在免疫后28d達到高峰，浸潤的炎癥細胞包括T淋巴細胞及少量的巨噬細胞。EAP全脾細胞轉(zhuǎn)輸能導(dǎo)致大鼠免疫性前列腺炎，但在轉(zhuǎn)輸前清除T淋巴細胞，則不能誘發(fā)免疫性前列腺炎的發(fā)生。國內(nèi)有學(xué)者采用前列腺類固醇結(jié)合蛋白作為免疫原進行造模，也取得了較好的效果。

CD4+輔助性T淋巴細胞對免疫的調(diào)節(jié)反應(yīng)具有異質(zhì)性，CD4+輔助性T淋巴細胞根據(jù)分泌的細胞因子不同分為四大亞群:Thl、Th2、Thl7和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞。研究顯示這種輔助性T淋巴細胞參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展，與自身免疫性疾病相關(guān)。Thl主要分泌IFM和IL l2等，能夠清除細胞內(nèi)病原菌，Th2分泌IL-5、IL-4、IL-l3等，能夠清除寄生蟲、細胞外感染病菌。Thl7淋巴細胞主要產(chǎn)生IL-17細胞因子，并因此而得名。研究顯示Th17輔助性T淋巴細胞與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血管炎、系統(tǒng)性硬化等多種自身免疫性疾病有關(guān)。IL-l7作為促炎因子，能夠誘導(dǎo)細胞集落刺激因子的分泌以及IL-8的分泌，從而對中性粒細胞發(fā)揮募集作用。其還能夠能夠促使單核細胞分泌TNF-α、IL-1β而加強炎癥反應(yīng)。IL-23是一種促炎癥細胞因子，主要由抗原提呈細胞分泌，能夠誘導(dǎo)Th-l7輔助性T淋巴細胞的分化，并誘導(dǎo)IL-l7的產(chǎn)生，因此其在自身免疫性疾病中也發(fā)揮著重要的作用。在本次研究中，前列腺炎模型小鼠前列腺組織中CD4+細胞核CD8+ T淋巴細胞顯著增加，并且Th 17+細胞的浸潤程度也顯著增加。采用PCR方法對IL-17、IL-23p19、IL-23p40 mRNA表達情況進行分析，結(jié)果也顯示其表達顯著升高。結(jié)果提示免疫性前列腺炎作為一種自身免疫性疾病，Th17 T淋巴細胞參與了其發(fā)生和發(fā)展的過程。研究顯示CD4 +T細胞對誘發(fā)前列腺炎癥狀具有重要的作用。

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Th17 T Lymphocytes Infiltration and Associated Cytokines Expression in Immunity Prostatitis Tissue

LI Feng， YE Xiangdong， LIAN Xuexiong， et al
(The Fourth Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University，Guangdong Guangzhou 511447，China)

【Abstract】Objective:To analyze Th17 T lymphocytes infiltration and associated cytokines expression in immunity prostatitis tissue. Method: 60 mouses were divided into study group and control group. Study group was made immunity prostatitis model. After model，Th17 T lymphocytes infiltration and associated cytokinesbook=468,ebook=120expression were detected. Result:CD4+，CD8+，IL-17+ T lymphocytes infiltration in immunity prostatitis tissue increased apparently(P<0.01). IL-17、IL-23p19、IL-23p40 mRNA expression in immunity prostatitis tissue increased apparently(P<0.01). Conclusion: Th17 T lymphocytes infiltration and associated cytokines expression in immunity prostatitis tissue.

【Key words】Immunity prostatitis tissue； Th17 T lymphocytes； Cytokines； IL-17

【基金項目】廣東省自然科學(xué)自由申請項目，(編號:S2012010009126)

【文章編號】1006-6233(2016)03-0467-04

【文獻標(biāo)識碼】B 【doi】10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.03.041