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        HBeAg陽性慢性乙型肝炎外周血T淋巴細(xì)胞上CD28表達(dá)初步研究

        2014-06-04 01:01:46齊青松劉志華徐建明
        中國現(xiàn)代醫(yī)生 2014年9期
        關(guān)鍵詞:T淋巴細(xì)胞乙型肝炎

        齊青松++++++劉志華+++徐建明++++++鐘培星++++++章小東

        [摘要] 目的 分析HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)特點(diǎn)。 方法 采集健康人、HBeAg陽性乙肝病毒攜帶者、HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的外周血,抗體標(biāo)記,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞,同時檢測肝功能、HBVDNA。 結(jié)果 慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞、CD28+T細(xì)胞明顯低于健康對照組(P<0.05);高病毒載量組(HBVDNA≥107組)CD8+CD28+T細(xì)胞低于低病毒載量組(HBVDNA<107組)(P<0.05)。結(jié)論 所有結(jié)果顯示乙型肝炎病毒持續(xù)感染狀態(tài)與CD8+T細(xì)胞上共刺激分子CD28的表達(dá)低下有關(guān), 而CD8+T細(xì)胞上CD28的低表達(dá)與高病毒載量有關(guān)。

        [關(guān)鍵詞] 乙型肝炎;T淋巴細(xì)胞;CD28

        [中圖分類號] R512.6+2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701(2014)09-0018-04

        HBV感染后的轉(zhuǎn)歸依賴于人體免疫狀態(tài)及其免疫應(yīng)答,強(qiáng)有力的免疫反應(yīng)針對病毒多種抗原產(chǎn)生特異性抗體最終清除病毒,而低下的免疫反應(yīng)不僅不能控制病毒復(fù)制而且導(dǎo)致持續(xù)感染和疾病進(jìn)展。CD8+T細(xì)胞作為主要效應(yīng)細(xì)胞,在病毒清除中起重要作用[1,2]。而T細(xì)胞正常激活需要共刺激信號,CD28是T細(xì)胞上重要的共刺激分子,CD28對T細(xì)胞活化起關(guān)鍵作用[3]。盡管多種治療的實施包括抗病毒藥物的應(yīng)用,最終能夠清除病毒的慢性乙型肝炎病例較少,因此筆者分析慢性乙型肝炎患者外周血CD28分子在T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況、并將乙肝感染者與健康人群比較、探討乙肝感染慢性化的原因。

        1 對象與方法

        1.1研究對象

        研究對象來自2012年7月~2013年8月廣東醫(yī)學(xué)院附屬東莞市厚街醫(yī)院傳染科門診及住院病區(qū)患者以及本院職工,從符合抗病毒標(biāo)準(zhǔn)[4]的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者中,知情同意后,抽取22例患者準(zhǔn)備接受抗病毒治療為A組,其中男13例,女9例,年齡21~45歲,平均(29.59±7.35)歲;另抽取21例HBeAg陽性慢性乙肝病毒攜帶者為B組,其中男13例,女8例,年齡20~45歲,平均(31.33±7.81)歲;本院HBsAg陰性的健康職工中抽取20例為C組,其中男12例,女8例,年齡21~42歲,平均(31.15±5.04)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):①6個月內(nèi)使用過抗乙肝病毒、免疫抑制劑等藥物;②同時感染甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、HIV;③伴有其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾?。◥盒阅[瘤、嚴(yán)重心臟病、糖尿病等)或免疫性疾病。

        1.2 研究方法

        1.2.1 主要試劑儀器 Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE購自美國ebioscience公司,BD-FACSCalibur II流式細(xì)胞分析儀。

        1.2.2 細(xì)胞染色流式細(xì)胞儀檢測分析 EDTA抗凝管抽取靜脈3 mL,1500 rpm/min離心5 min后,3 mLD-Hanks液小心稀釋沉淀,再次1500 rpm/min離心20 min后,小心將白膜層細(xì)胞吸出。D-Hanks液洗滌一次后,加入Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE抗體室溫避光染色30min,然后2%小牛血清PBS洗滌2次后,BD-FACSCaliburⅡ流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測并進(jìn)行結(jié)果分析。

        1.2.3 HBVDNA、肝功能、乙肝六項、甲丙丁戊肝抗體、HIV抗體檢測 HBV-DNA定量檢測采用ABI7000檢測儀,乙肝六項、甲丙丁戊肝抗體、HIV抗體檢測采用ELISA方法進(jìn)行,肝功能使用貝克曼DXC800自動化分析儀。

        1.3統(tǒng)計學(xué)處理

        應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各組標(biāo)準(zhǔn)化的樣本數(shù)值用(x±s)表示,兩組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        所有檢測數(shù)值為各T細(xì)胞亞群占CD3+T細(xì)胞百分比計算,CD3+T細(xì)胞代表總T淋巴細(xì)胞。

        2.1 三組T細(xì)胞亞群比較

        將A組(慢性乙型肝炎組)、B組(乙肝病毒攜帶組)、C組(健康對照組)年齡進(jìn)行比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        2.2相關(guān)指標(biāo)比較

        A組、B組CD4+T細(xì)胞百分率、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值低于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),A組、B組CD8+T細(xì)胞百分率高于健康對照組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);見表1。A組、B組CD28+T細(xì)胞、CD4+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞百分率低于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而A組、B組之間CD4+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        2.3 不同病毒載量患者T細(xì)胞亞群比較

        筆者按病毒載量HBVDNA≥107、HBVDNA<107分組比較,高拷貝組CD4+CD28+T細(xì)胞百分率低于低拷貝組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);高拷貝組CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞百分率低于低拷貝組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

        2.4 慢乙肝病人及健康人外周血T淋巴細(xì)胞亞群上CP28分子表達(dá)

        以單個慢性乙型肝炎病人、乙肝攜帶者、健康人為例,采用流式細(xì)胞儀分析外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞亞群以及各亞群CD28分子表達(dá)情況。見圖1~3。

        3 討論

        乙肝病毒感染發(fā)病與清除機(jī)制尚未完全弄清,普遍認(rèn)為與感染者免疫狀態(tài)有關(guān),CD4+T細(xì)胞為輔助性T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞是清除病原體的主要效應(yīng)細(xì)胞,其中CTL(cytotoxix T lymphocyte,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)在控制感染及清除病原體過程中起著關(guān)鍵作用[5、6],CD8+CD28+T細(xì)胞就是CTL。

        T細(xì)胞功能正常是以活化為前提的,它的激活必須經(jīng)過雙信號, 第一信號通過T細(xì)胞抗原受體識別并結(jié)合抗原遞呈細(xì)胞表面的MHC(major histocompatibility complex,主要組織相容性復(fù)合體)-抗原肽產(chǎn)生,第二信號通過T細(xì)胞上CD28與抗原遞呈細(xì)胞上的B7分子結(jié)合產(chǎn)生[7]。近10余年,許多新的共刺激通路和共刺激分子被發(fā)現(xiàn),雙信號理論也得到不斷完善,傳統(tǒng)的CD28/B7通路仍然是最主要的共刺激通路,因此筆者對慢性乙型肝炎患者外周血T細(xì)胞上CD28表達(dá)情況進(jìn)行研究。

        本研究選取22例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者和21例乙肝病毒攜帶者,并選擇20例本院健康職工為對照組,由于CD28表達(dá)隨著年齡的增長而逐步下調(diào)[8],筆者對三組年齡進(jìn)行比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,因而具有可比性。研究結(jié)果顯示:①慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細(xì)胞明顯低于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與Arasli[9]、范振平[10]報道一致。有研究表明,CD4+T細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞的增殖與活化具有重要調(diào)節(jié)作用[11],CD4+T細(xì)胞自身同樣需要活化,CD4+CD28+T細(xì)胞減少表明能被活化的CD4+T細(xì)胞減少,因而CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用受影響,必然在一定程度上影響到CD8+T細(xì)胞的增殖與活化。②慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD8+CD28+T細(xì)胞低于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與范振平[10]、王沂芹[12]報道結(jié)果一致。因此,以上結(jié)果表明乙肝感染者CD4+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞減少與乙肝感染持續(xù)狀態(tài)有相關(guān)性。③慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。理論上,慢性乙型肝炎處于免疫激活狀態(tài),乙肝病毒攜處于免疫耐受狀態(tài),他們之間應(yīng)該存在差異,本研究結(jié)果可能與樣本含量有關(guān),需要擴(kuò)大樣本量。不過,無論是慢性肝炎還是乙肝病毒攜帶者,最終能清除病毒的比例極少,顯示兩者免疫狀態(tài)沒有本質(zhì)上的區(qū)別,可能是免疫耐受程度稍有差異。

        另外,筆者將研究對象按照病毒載量高低分為HBVDNA≥107、HBVDNA<107兩組,結(jié)果病毒載量越高,CD8+CD28+T細(xì)胞百分率越低,而CD4+CD28+T細(xì)胞百分率并不受HBV病毒載量的影響,提示HBV高復(fù)制與CD8+T細(xì)胞的CD28分子的低表達(dá)有相關(guān)性。不過,并非只有HBV感染出現(xiàn)CD8+T細(xì)胞上CD28分子的表達(dá)低下,HIV、EBV等病毒[13、14]也出現(xiàn)同樣表現(xiàn),結(jié)合目前實驗結(jié)果,筆者推測,HBV特異性CTL長期暴露在大量抗原刺激,可能導(dǎo)致CD8+CD28+T細(xì)胞消耗性減少,因而表現(xiàn)為乙肝感染者CD8+T細(xì)胞上CD28分子的表達(dá)下調(diào)。但是,最近有研究發(fā)現(xiàn)[15]慢性乙型肝炎患者外周血游離CD28較健康人增多,結(jié)合慢性乙型肝炎患者CD8+CD28+T細(xì)胞減少這一現(xiàn)象是否暗示著:CD8+CD28+T細(xì)胞減少另外一個原因可能是CD8+CD28+T細(xì)胞上CD28+分子與之解離導(dǎo)致?這還需要進(jìn)一步論證。

        [參考文獻(xiàn)]

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        (收稿日期:2013-12-09)

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        (收稿日期:2013-12-09)

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        (收稿日期:2013-12-09)

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