陳　勇，應　穎，李　蓁，黃海燕，龔瓊瑤

(寧波市第二醫(yī)院風濕免疫科，浙江寧波 315010)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(4)：340- 345

原發(fā)性痛風是指尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)和結(jié)締組織而引起的炎癥反應，高尿酸血癥是其危險因素[1]。流行病學研究報道，在很多國家原發(fā)性痛風和高尿酸血癥的患病率逐年增加[2]。薈萃分析數(shù)據(jù)顯示，2000年至2014年中國大陸高尿酸血癥的患病率約為13.3%，痛風為1.1%[3]。

目前，越來越多原發(fā)性痛風發(fā)病機制研究主要集中在固有免疫上。Toll樣受體介導的NF-κB途徑和NALP3[NACHT，富含亮氨酸重復單位(leucine-rich repeat，LRR)和PYD(pyrin-domain)結(jié)構(gòu)域的蛋白3]炎性體通過產(chǎn)生和激活成熟的白細胞介素1(interleukin- 1，IL- 1)，從而導致急性痛風發(fā)作[4]。P2X7受體(P2X配體門控離子通道7受體，P2X7R)也稱為腺苷三磷酸受體，已被證實為急性痛風發(fā)作的一個關(guān)鍵因素[5]。近幾年，全基因組關(guān)聯(lián)研究報道了單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和原發(fā)性痛風之間存在關(guān)聯(lián)[6]。文獻報道P2RX7基因多態(tài)性(rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447)可能影響IL- 1β分泌，從而在原發(fā)性痛風發(fā)病機制中起著重要的作用[7]。本研究目的是探討中國漢族男性人群中P2RX7基因多態(tài)性(rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447)與原發(fā)性痛風發(fā)病的相關(guān)性。

對象和方法

研究對象

原發(fā)性痛風組：219例原發(fā)性痛風患者來自2014年10月至2016年3月就診于寧波市第二醫(yī)院的門診及住院患者，均為中國漢族男性，平均年齡(50±14.85)歲，所選人群之間均無血緣關(guān)系。原發(fā)性痛風診斷符合1977年美國風濕病協(xié)會制訂的標準[8]。該研究得到寧波大學醫(yī)學院寧波市第二醫(yī)院倫理委員會批準，并遵守赫爾辛基宣言的倫理原則。

健康對照組：247例健康對照者來自2014年10月至2016年3月寧波市第二醫(yī)院的體檢者。并排除痛風等風濕性疾病、癌癥、高血壓、糖尿病、高脂血癥、肝病、腎病和血液病史，均為中國漢族男性，平均年齡(44.03±10.75)歲，所選人群之間均無血緣關(guān)系，參加者簽署知情同意書。

方法

外周血DNA提取：抽取靜脈血2 ml，收集入2% EDTA管中。取200 μl全血用QIAamp DNA試劑盒(Qiagen公司，德國希爾登)提取全基因組DNA，并置于-80 ℃冰箱保存。

目的片段擴增：用Primer5.0軟件對P2RX7基因的7個單核苷酸多態(tài)性(rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447)進行引物設計。并用SNaPshot方法進行基因分型。

基因分型檢測：用3730測序儀進行基因分型檢測，并用GeneMapper 4.0軟件對測序結(jié)果進行分析。

統(tǒng)計學處理

結(jié)　　果

臨床資料和生化指標比較

原發(fā)性痛風組年齡、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清肌酐、血清尿酸、血糖、血清總膽固醇、血清三酰甘油、白細胞計數(shù)明顯高于健康對照組，而高密度脂蛋白膽固醇水平明顯低于健康對照組(P<0.001)。兩組低密度脂蛋白膽固醇水平相比，差異無統(tǒng)計學意義[原發(fā)性痛風組：(2.54±0.91)mmol/L；健康對照組：(2.64±0.50)mmol/L，P=0.293](表1)。

基因型和等位基因比較

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，在原發(fā)性痛風組和健康對照組中，P2RX7 rs2230911、rs208294和rs435309 3個基因位點處于遺傳平衡，具有群體代表性(P>0.05)。在原發(fā)性痛風組和健康對照組中，P2RX7 rs2230911基因型頻率(CC 63.0%，CG 34.7%，GG 2.3%)和等位基因頻率(C 80.4%，G 19.6%)差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.012和0.013)。 在原發(fā)性痛風患者中，G等位基因的頻率明顯高于對照組[OR(95%CI)=1.56(1.10, 2.21)，P=0.013]。將rs2230911進行顯性模型CC和CG+GG比較，基因型在原發(fā)性痛風組和健康對照組亦存在明顯差異[OR(95%CI)=1.79(1.20, 2.67)，P=0.005]。而P2RX7 rs208294和rs435309基因型或等位基因頻率在原發(fā)性痛風組和健康對照組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。將P2RX7 rs208294和rs435309分成顯性模型TT和TC+CC或隱性模型TT+TC和CC，基因型頻率在兩組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2、3)。

表1　原發(fā)性痛風組與健康對照組臨床資料和生化指標Table 1　Clinical data and biochemical indexes of primary gout patients and

ALT:谷丙轉(zhuǎn)氨酶； AST:谷草轉(zhuǎn)氨酸； CREA:肌酐； UA:尿酸； GLU:血糖； TC:總膽固醇； HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇； LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇； TG:三酰甘油； CRP:C反應蛋白； WBC:白細胞計數(shù)

表2　原發(fā)性痛風組與健康對照組rs2230911,rs208294,rs435309和rs28360447基因型和等位基因頻率Table 2　Genotype and allele frequencies of rs2230911,rs208294,rs435309 and rs28360447 in primary gout patients and controls

HEW:Hardy-Weinberg平衡檢驗

原發(fā)性痛風組P2RX7rs2230911基因型之間與臨床生化資料比較

將P2RX7 rs2230911的基因型分為CC、CG和GG三組。在原發(fā)性痛風組中，CC、CG和GG三組間血糖水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)；顯性模型中CC和CG+GG兩組間血糖和高密度脂蛋白膽固醇水平差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.032和0.049)。其他變量在各組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

討　　論

P2X7受體是一個由595個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是配體門控通道家族中的一員[9- 10]。P2RX7基因在單核細胞和固有免疫中發(fā)揮著重要作用，主要包括Toll樣受體介導的NF-κB途徑和NALP3炎性體途徑[11- 12]。當細胞外的ATP濃度發(fā)生急劇的變化時，P2X7受體被激活并開放，導致K+外流和Na+和Ca2+內(nèi)流，從而進一步導致細胞因子如IL- 1的釋放和活化[13- 16]。 IL- 1β是IL- 1的活性形式，在導致原發(fā)性痛風的急性發(fā)作中充當著重要的角色[17- 18]。有研究發(fā)現(xiàn)，P2RX7基因與類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性淋巴細胞性白血病硬化、多發(fā)性硬化、結(jié)核病和克羅恩病等相關(guān)[19- 23]。

P2RX7基因具有高多態(tài)性，其中位點包括rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447等。rs2230911(T357S

表3　原發(fā)性痛風組與健康對照組rs2230911,rs208294和rs435309基因型頻率Table 3　Allele frequencies of rs2230911,rs208294, and rs435309 in primary gout patients and controls

表4原發(fā)性痛風組rs2230911基因型的生化指標比較
Table4Comparation of biochemical indexes in primary gout patients with genotype of rs2230911

分組年齡(歲)ALT(IU/L)AST(IU/L)CREA(μmol/L)UA(μmol/L)GLU(mmol/L)CC50.09±14.9639.10±37.8427.28±13.6283.59±19.01432.76±150.905.50±1.57CG52.78±14.9835.07±23.1728.17±15.0582.51±17.01411.74±138.646.35±1.92GG46.00±5.6639.80±23.2725.80±12.1573.72±8.53521.40±156.884.86±1.11P1值0.3390.4840.8790.4780.2260.047P2值0.2760.4450.7220.530.5290.032P3值0.1190.8890.7790.250.150.603分組TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)CC4.99±1.051.28±0.302.54±0.882.50±1.5311.01±21.028.33±3.01CG4.77±1.261.15±0.332.52±1.012.31±1.389.57±17.237.98±3.10GG5.02±0.671.18±0.272.82±0.422.25±0.815.10±5.5211.08±5.07P1值0.6360.1440.9060.820.7490.094P2值0.3670.0490.990.5290.6970.76P3值0.9040.7880.6610.8560.6990.275

P1：CC、CG和GG間比較；P2：CC與CG+GG比較；P3：CC+CG與GG比較； ALT:谷丙轉(zhuǎn)氨酶； AST:谷草轉(zhuǎn)氨酸； CREA:肌酐； UA:尿酸； GLU:血糖； TC:總膽固醇； HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇； LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇； TG:三酰甘油； CRP:C反應蛋白； WBC:白細胞計數(shù)

或1096C→G)是指在P2RX7基因的第1096個位點上，堿基胞嘧啶(C)突變?yōu)轼B嘧啶(G)，從而導致蘇氨酸突變成色氨酸[24- 25]。該位點多態(tài)性不僅與原發(fā)性痛風相關(guān)，與其他免疫疾病也存在著密切的聯(lián)系。2013年的一篇實驗性文章報道了rs2230911與系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎病有著密切的關(guān)系，而等位基因rs2230911-G為保護因素[26]。在HapMap數(shù)據(jù)庫中，中國人群rs2230911-G的等位基因頻率為24.4%，而在本研究中，rs2230911-G的等位基因頻率為13.6%，兩者差異無統(tǒng)計學意義。等位基因C是原始堿基；而等位基因G是突變堿基，是發(fā)生原發(fā)性痛風的危險因素。突變純合型GG和突變雜合型CG患者與野生型CC患者相比，更易發(fā)生原發(fā)性痛風。此外，突變純合型GG和突變雜合型CG患者更易發(fā)生高血糖和低高密度脂蛋白膽固醇，并可能進展為糖尿病和代謝綜合征。本研究結(jié)果提示可以對P2RX7 rs2230911基因型為GG和GC的患者進行早期干預，以避免患者發(fā)展為原發(fā)性痛風、糖尿病等。

P2RX7 rs208294(His155Tyr，H155Y或489T→G)是指組氨酸突變成酪氨酸，此突變改變了P2X7受體胞外的結(jié)構(gòu)域，并影響了受體單元結(jié)構(gòu)的組裝。Giulio等[27]研究發(fā)現(xiàn)，rs208294的多態(tài)性能增強慢性淋巴細胞白血病患者P2X7受體的功能。之后的研究還發(fā)現(xiàn)，rs208294多態(tài)性在風濕性關(guān)節(jié)炎患者中亦可以增強P2X7受體的功能[28]。等位基因C的頻率在HapMap數(shù)據(jù)庫和在本研究中分別為30.5%和39.5%。P2RX7 rs435309(亦稱為rs1752809，Val76Ala，253T→C)的突變導致了P2X7受體功能的高度損傷[29]。在本研究的健康對照組中，等位堿基C頻率為46.4%。但在HapMap數(shù)據(jù)庫中沒有該項數(shù)據(jù)的報道。

P2RX7 rs28360447多態(tài)性不符合Hardy-Weinberg平衡，這意味著所選樣本未能代表整個群體樣本，因此本實驗未進行下一步的基因型和等位基因頻率的分析。Sebastien等[29]的實驗證實了P2RX7 rs28360447(Gly150Arg，G150R或474G→A)多態(tài)性會導致受體功能的完全喪失。在Daniel的一項在混合人群中的實驗發(fā)現(xiàn)，等位基因A頻率約為1.3%，然而在我們的研究中，該等位基因的頻率為0。

本研究存在一定的局限性。首先，樣本量不足導致P2RX7 rs28360447多態(tài)性未能符合Hardy-Weinberg平衡，從而無法進行該位點的統(tǒng)計學處理。第二，所有病例組和健康對照樣本都來自同一家醫(yī)院，因此可能存在選擇偏倚。第三，本研究只涉及中國漢族男性，其結(jié)果不能代表女性及其他種族人群。此外，P2RX7基因有其他多態(tài)性位點，如rs7958311、rs7958316、rs2230912、rs1653624和rs35933842等，可能也與原發(fā)性痛風的發(fā)病風險相關(guān)。

綜上所述，本研究認為P2RX7 rs2230911多態(tài)性在中國漢族男性人群中，可能與原發(fā)性痛風的發(fā)病風險相關(guān)，其中等位基因G可能是原發(fā)性痛風的危險因素。

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