王會(huì)丹，葉利遠(yuǎn)，井申榮，孟增東

（1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650500；2.昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院骨科，昆明650032；3.云南省第一人民醫(yī)院骨科，昆明650032）

1 引 言

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是骨髓中一類(lèi)具有多分化潛能、自我復(fù)制和高度增殖的干細(xì)胞，誘導(dǎo)后分化為成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種組織細(xì)胞[1]，可作為骨組織工程的理想種子細(xì)胞。與一般羥基磷灰石（HA）相比，納米羥基磷灰石（nHA）具有更好的生物活性和生物相容性，能夠更好的與BMSCs復(fù)合并促進(jìn)BMSCs的增殖和分化。然而，目前針對(duì)BMSCs與nHA的很多研究只是在體外和動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，并沒(méi)有臨床上的實(shí)際應(yīng)用。本研究通過(guò)對(duì)體外和動(dòng)物體內(nèi)研究進(jìn)行綜述，找出二者復(fù)合的影響因素，為BMSCs與nHA復(fù)合骨修復(fù)材料臨床應(yīng)用的可行性提供依據(jù)。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）

BMSCs廣泛分布于骨髓組織、肌肉組織、骨骼組織等多種組織以及臍帶血內(nèi)，具有自我復(fù)制和多向分化的潛能。備受很多研究者關(guān)注，并在臨床研究中得到廣泛應(yīng)用，尤其是骨組織工程。

根據(jù)各個(gè)階段細(xì)胞表面抗原不同，BMSCs演變?yōu)槌晒羌?xì)胞過(guò)程可分為5個(gè)階段：骨祖細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、過(guò)度型成骨細(xì)胞、分泌型成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞型成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞，這五個(gè)階段為研究BMSCs的成骨分化奠定了理論基礎(chǔ)。因膠原蛋白I型（collagen I）本身在未分化的BMSCs中少量表達(dá)，待 BMSCs分化后collagen I的表達(dá)量升高，而骨鈣蛋白（osteocalcin）、骨橋蛋白（osteopontin）和堿性磷酸酶（ALP）以及鈣結(jié)節(jié)只在分化BMSCs中表達(dá)、形成。所以，collagen I、osteocalcin、osteopontin表達(dá)水平和 ALP的活性可作為檢測(cè)BMSCs分化、礦化的重要檢測(cè)指標(biāo)[2-4]。

3 納米羥基磷灰石（nHA）

骨組織工程的發(fā)展為骨缺損修復(fù)帶來(lái)希望，且大量研究已證實(shí)，骨組織工程方法構(gòu)建的組織工程骨應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的可行性[5]，其主要成分是納米羥基磷灰石。

羥基磷灰石 （HA，Ca10（PO4）6（OH）2）是天然骨的主要成分，具有很好的生物相容性、生物活性和骨傳導(dǎo)性[6-7]，是一種很有希望的生物材料。但因純HA支架材料生物力學(xué)性能欠佳，脆性大，且粉末能從骨植入部位發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致異位骨的形成，所以限制了它在骨組織工程中的應(yīng)用[8-9]。

天然骨組織中的HA是以十幾納米的晶體狀態(tài)存在，排列有序，為骨組織提供良好的力學(xué)性能[10]。與普通HA相比，nHA復(fù)合材料成分與天然骨組織成分更相近，且一些力學(xué)性能也得到改善，例如彈性、模量、強(qiáng)度、剛度等[11]。與微米級(jí) HA相比，納米級(jí)HA表面聚集更多原子，增強(qiáng)了nHA的活性，便于與骨組織結(jié)合[12]。同時(shí)在納米復(fù)合材料中，由于有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的聚合，表現(xiàn)出二者所沒(méi)有的特性[13]，因此，很多能與nHA聚合并促進(jìn)其降解的無(wú)毒有機(jī)聚合物被研發(fā)出來(lái)，例如脫乙酰殼聚糖（CS，（C6H11O4N）n）[14]等。總之，nHA除具有生物可降解性和無(wú)毒性之外，還表現(xiàn)出其他相關(guān)良好的特性，包括較好的生物相容性、更好的抗菌活性和最小的異物反應(yīng)性[15-16]。

4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與納米羥基磷灰石的復(fù)合

4.1 BMSCs與nHA體外復(fù)合和動(dòng)物體內(nèi)研究的主要步驟

利用密度梯度離心法，體外獲取BMSCs進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。取其第三或四代細(xì)胞與不同濃度nHA顆粒材料在恒溫箱中共培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，添加誘導(dǎo)液[17]，誘導(dǎo)后將BMSCs與nHA復(fù)合效果最好的支架材料植入骨缺損動(dòng)物體內(nèi)，觀察它與天然骨的愈合和體內(nèi)降解情況[18]。植入不同時(shí)間后，分別將動(dòng)物處死，取出植入部位的組織，經(jīng)免疫組織分析，確定支架體內(nèi)降解情況和植入體內(nèi)的可行性。

4.2 BMSCs與nHA體外復(fù)合和動(dòng)物體內(nèi)研究的檢測(cè)技術(shù)和指標(biāo)

針對(duì)BMSCs與nHA復(fù)合在體外和動(dòng)物水平上的檢測(cè)可概括為以下幾方面：首先，在復(fù)合后不同時(shí)間點(diǎn)，使用倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察誘導(dǎo)一段時(shí)間后的培養(yǎng)樣品，檢測(cè)BMSCs與nHA的復(fù)合情況，觀察BMSCs在nHA上的形態(tài)學(xué)變化。其次，對(duì)BMSCs細(xì)胞基質(zhì)中的肌動(dòng)蛋白染色并用帶有熒光的探針標(biāo)記，確定BMSCs在nHA顆粒上的粘附性和nHA顆粒對(duì)細(xì)胞骨架組裝的影響。然后，用MTT法或流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，確定細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況。最后，可用馬松法和鈣鈷法[19]分別對(duì)collagen I和堿性磷酸酶（ALP）染色，檢測(cè)其表達(dá)水平和表達(dá)活性，確定細(xì)胞是否已分化和nHA顆粒是否對(duì)BMSCs的分化有促進(jìn)作用。

活性氧自由基（ROS）對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，若不被抗氧化劑保護(hù)，細(xì)胞膜功能將發(fā)生紊亂、蛋白質(zhì)降解、DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。故細(xì)胞內(nèi)ROS的水平能夠反映細(xì)胞壞死狀態(tài)，可通過(guò)熒光探針測(cè)定BMSCs內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平，研究nHA對(duì)細(xì)胞壞死的影響。Caspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中一種重要的蛋白酶，可通過(guò)檢測(cè)BMSCs中Caspase-3／7的活性和進(jìn)行膜聯(lián)蛋白碘化丙啶染色（PI），用細(xì)胞流式儀確定nHA對(duì)BMSCs凋亡的影響。此外，針對(duì)細(xì)胞的礦化情況，可用銀染法（Von Kossa）或茜素紅染色法[17]對(duì)沉積在細(xì)胞外基質(zhì)的鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行染色檢測(cè)。至于從動(dòng)物體內(nèi)取出的植入部位組織，切片后分別用蘇木精-伊紅（HE）和馬松染料對(duì)骨形成區(qū)域、nHA支架區(qū)域和膠原區(qū)域進(jìn)行染色，觀察其各自區(qū)域的面積百分比，確定支架體內(nèi)降解情況和植入體內(nèi)的可行性。

4.3 BMSCs與nHA體外復(fù)合和動(dòng)物體內(nèi)研究的影響因素

4.3.1 nHA的屬性對(duì)BMSCs生長(zhǎng)和增殖的影響一般nHA的孔徑大小為100～400μm時(shí)更有利于細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)，孔隙率大于80%時(shí)最有利于細(xì)胞附著生長(zhǎng)[20]。除孔徑和孔隙率的影響之外，nHA表面粗糙程度也可因影響B(tài)MSCs基因的表達(dá)而影響細(xì)胞增殖的速率[21]。當(dāng)nHA與BMSCs在血清中共培養(yǎng)時(shí)，nHA的血清蛋白吸附能力優(yōu)于微米羥基磷灰石[22]，且吸附的血清蛋白能促進(jìn)細(xì)胞增殖。同樣相比于微米羥基磷灰石的粗糙表面，細(xì)胞更容易在nHA的光滑表面貼壁和增殖[23-24]，主要是因其較微米羥基磷灰石具有更好的親水性和更低的負(fù)電荷?？傊琻HA的屬性對(duì)BMSCs的影響因素有nHA孔徑、孔隙率、表面粗糙程度、蛋白吸附能力以及羥基磷灰石顆粒是否為納米級(jí)。

4.3.2 nHA濃度對(duì)BMSCs形態(tài)、骨架組裝、生存力、壞死和凋亡的影響 經(jīng)BMSCs檢測(cè)指標(biāo)分析，在高濃度nHA顆粒的懸浮液中共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞發(fā)生聚集、邊緣不規(guī)則化、肌動(dòng)蛋白組裝受到抑制，并且出現(xiàn)一些不能擴(kuò)張的液泡。然而，在低濃度的nHA懸浮液中，細(xì)胞的形態(tài)與對(duì)照組相似，它們都由成纖維樣變?yōu)槔庑巍Ｓ纱丝芍?，僅高濃度的nHA對(duì)細(xì)胞形態(tài)、骨架組裝、生存力、粘附性都存在影響。同樣，通過(guò)nHA濃度對(duì)BMSCs壞死和凋亡的研究，隨著nHA濃度的增加，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，ROS的含量越高，細(xì)胞壞死越快，而早期細(xì)胞凋亡百分比卻出現(xiàn)下降，晚期的細(xì)胞凋亡百分比變化不顯著。這表明nHA顆粒僅對(duì)細(xì)胞壞死有影響，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4.3.3 鈣磷離子對(duì)BMSCs礦化和生長(zhǎng)的影響 由于細(xì)胞不能分泌過(guò)多鈣磷離子用于形成磷酸鹽和碳酸鹽，以致細(xì)胞不能礦化。當(dāng)向培養(yǎng)液中加入鈣磷離子時(shí)，細(xì)胞的礦化程度隨鈣離子濃度的升高而增強(qiáng)，但對(duì)磷離子的濃度變化不顯著。然而，升高磷離子濃度和降低鈣磷離子濃度均能限制細(xì)胞生長(zhǎng)，僅升高鈣離子濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。鈣磷離子是細(xì)胞礦化的原材料，向培養(yǎng)液中加入鈣磷離子，雖有利于成骨細(xì)胞的礦化[25]，但對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響。

4.3.4 BMSCs對(duì)nHA支架降解的影響 對(duì)染色區(qū)域經(jīng)電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）觀察，隨著復(fù)合時(shí)間的延長(zhǎng)，骨形成區(qū)域面積隨之增加，支架區(qū)域面積隨之減少，且支架的降解速率與骨形成的速度成正相關(guān)。由此可知，BMSCs可促進(jìn)支架的降解[18]。同時(shí)nHA的孔壁厚度逐漸減小，孔徑逐漸變大，最終孔破裂，nHA支架消失。經(jīng)研究得出如下兩方面原因：（1）外源植入物導(dǎo)致肌肉損傷后，參與其中炎性反應(yīng)的酶和細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基和超氧陰離子能加速生物材料降解[26]。（2）成骨和血管的協(xié)同作用可促進(jìn)支架降解，它們通過(guò)招募本地的巨細(xì)胞去侵蝕和吸收支架，同時(shí)增加血液供應(yīng)，清除代謝產(chǎn)物[27]。

然而，目前骨組織工程支架材料體內(nèi)降解的確切機(jī)制尚不清楚，且降解速度比較慢，時(shí)間比較長(zhǎng)。BMSCs在復(fù)合材料上能夠生長(zhǎng)、增殖、分化、壞死、凋亡和礦化的確切機(jī)制和信號(hào)通路也尚不被熟知。由于骨組織工程技術(shù)和方法尚未顯現(xiàn)出更大的突破，支架材料的研究仍停留在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，臨床上的研究還不成熟。

5 展望

BMSCs的自我復(fù)制和多向分化潛能為二者的復(fù)合奠定了基礎(chǔ)，nHA的特性為二者的復(fù)合提供了良好條件。collagen I、osteocalcin、osteopontin和堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)量以及鈣結(jié)節(jié)的形成，為BMSCs的成骨分化和礦化提供了檢測(cè)指標(biāo)。nHA的孔徑和孔隙率不僅是良好nHA支架材料的重要評(píng)定參數(shù)指標(biāo)，而且nHA合適的濃度、孔徑和孔隙率也為細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)提供了重要的先決條件。與微米級(jí)HA相比，nHA不僅具有更好的生物相容性、生物活性和骨傳導(dǎo)性，還能促進(jìn)BMSCs的增殖。希望在不久的將來(lái)，研究者能研制出更好的仿生nHA骨修復(fù)材料，廣泛應(yīng)用于臨床。