鄭惠惠,　江　洪

北京萬達因生物醫(yī)學技術有限責任公司, 北京 141017

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CHO細胞表達系統(tǒng)研究進展

鄭惠惠,江洪*

北京萬達因生物醫(yī)學技術有限責任公司, 北京 141017

CHO細胞表達系統(tǒng)是目前重組糖蛋白生產(chǎn)的首選系統(tǒng)。隨著無血清懸浮培養(yǎng)技術、基因工程技術和大規(guī)模培養(yǎng)技術的應用和不斷發(fā)展，CHO細胞表達系統(tǒng)已經(jīng)成為生物技術藥物最重要的表達或生產(chǎn)系統(tǒng)，并被廣泛應用于抗體、重組蛋白藥物和疫苗等產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)中。近年來，針對CHO細胞表達系統(tǒng)在某些重組蛋白的表達和大規(guī)模生產(chǎn)中存在的不足，研究者們通過利用基因工程技術手段，結合重組蛋白表達機制的研究成果，為優(yōu)化和應用CHO細胞表達系統(tǒng)做出了不懈努力。從培養(yǎng)基的優(yōu)化、高產(chǎn)重組CHO細胞株的構建、大規(guī)模培養(yǎng)三個方面綜述了CHO細胞表達系統(tǒng)的最近研究進展，以期為CHO細胞表達系統(tǒng)的研究與應用提供參考。

CHO細胞培養(yǎng)；細胞改造；重組抗原表達

CHO 細胞是由Puck于1957年建成的中國倉鼠卵巢成纖維細胞系。發(fā)展至今，CHO細胞已成為生物技術藥物最重要的表達或生產(chǎn)系統(tǒng)。隨著無血清懸浮培養(yǎng)技術、基因工程技術、生物反應器設計放大與強化技術、大規(guī)模高密度流加和連續(xù)灌注培養(yǎng)技術等的發(fā)展，CHO細胞系統(tǒng)被廣泛應用于抗體、基因重組蛋白質(zhì)藥物、病毒疫苗等生物技術產(chǎn)品的研究開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)中。

CHO 細胞是目前重組糖基蛋白生產(chǎn)的首選體系。因為它具有準確的轉錄后修飾功能，表達的蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面更接近于天然蛋白分子。但CHO細胞在無血清培養(yǎng)基中會出現(xiàn)活力差、分泌外源蛋白能力弱等問題。所以建立穩(wěn)定、高產(chǎn)的重組CHO細胞成為很多研究者的目標。近年來，研究者從細胞營養(yǎng)、代謝、凋亡、信號傳導等角度，結合蛋白表達機制等研究成果，對這一目標的實現(xiàn)做出了很多努力。本文從培養(yǎng)基優(yōu)化、高產(chǎn)重組CHO細胞株的構建、大規(guī)模培養(yǎng)三個方面綜述了CHO細胞表達系統(tǒng)的最新研究進展,以期為CHO細胞表達系統(tǒng)的應用提供參考。

1　培養(yǎng)基的優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，不同的細胞株甚至克隆對營養(yǎng)成分的需求都有差別。通過篩選比較不同培養(yǎng)基成分對重組抗原生產(chǎn)的影響，并開發(fā)適用于不同重組CHO細胞株的培養(yǎng)基，成為很多研究者提高CHO細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)量的重要方式。為了維持細胞在無血清培養(yǎng)基中的正常生長，需要在基礎培養(yǎng)基中添加很多其他因子，如激素、生長因子、蛋白水解物等。

蛋白質(zhì)水解物含有豐富的營養(yǎng)成分，可有效縮短細胞對無血清培養(yǎng)基的適應過程。Davami等[1]通過組合比較不同來源的蛋白水解物對細胞密度及表達產(chǎn)量的影響，優(yōu)化得到更適于DG44的培養(yǎng)基。酵母水解物作為一種成本較低的非動物源蛋白水解物，可以使細胞密度增加的同時，使重組表達抗體的表達量大幅提高[2]。大豆水解物等都可以被添加到基礎培養(yǎng)基中[1,3,4]。由于蛋白水解物的構成復雜，且批間差異大，因此蛋白水解物的添加會影響細胞培養(yǎng)基批次間的穩(wěn)定性。如果去除培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)水解物，需要添加氨基酸或微量元素等，通過優(yōu)化調(diào)整其比例，仍能支持高密度的CHO細胞培養(yǎng)[5]。

劉興茂等[6]采用Plackett-Burman實驗對影響細胞生長的培養(yǎng)添加成分進行了考察，確定了腐胺、胰島素及轉鐵蛋白對11G-S細胞的懸浮培養(yǎng)有明顯的生長促進作用。設計的培養(yǎng)基可以使細胞最大生長密度達到4.12×106cells/mL。Xu等[7]采用Plackett-Burman設計與支持向量機(SVM)預測并實驗確定了硫酸鋅、轉鐵蛋白及BSA對CHO-K1細胞的生長有促進作用。另有研究表明，使用檸檬酸鐵作為轉鐵蛋白的替代物，可以使細胞的密度達到7.0 ×106cells/mL，但是會降低轉染效率[8]。Miki等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加生長因子IGF-1和脂類信號分子溶血磷脂酸(LPA)也可以有效加速CHO細胞生長。

優(yōu)化培養(yǎng)基能有效提高重組CHO細胞的培養(yǎng)密度。高密度的CHO細胞培養(yǎng)是CHO細胞表達系統(tǒng)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)應用的必要條件之一。與大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)相比，CHO細胞有生長較慢、培養(yǎng)周期較長、產(chǎn)量較低等缺點。為了提高重組蛋白產(chǎn)量、擴大CHO細胞表達系統(tǒng)的生產(chǎn)應用范圍，研究者們在優(yōu)化培養(yǎng)基的實驗基礎上，構建高產(chǎn)的重組CHO細胞系，為大規(guī)模的重組蛋白生產(chǎn)提供基礎。

2　高產(chǎn)重組CHO細胞株的構建

研究者們利用發(fā)展迅速的基因編輯技術對CHO細胞進行篩選和改造，得到高產(chǎn)的重組細胞株。研究者們通過過量表達或敲除某個基因，調(diào)整代謝途徑、延緩細胞凋亡、增強轉錄表達效率，有效的增加了重組蛋白產(chǎn)量。通過結合全基因組測序和基因敲除技術的研究成果，研究者們?yōu)榈玫椒磻愿玫奶腔亟M蛋白做出了不懈努力。

2.1調(diào)整代謝途徑

乳酸作為糖酵解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會影響細胞生長。Zhou等[10]使用siRNA 技術降低乳酸脫氫酶A(LDHa)和丙銅酸脫氫酶激酶(PDHKs)基因的表達，使乳酸的產(chǎn)生降低了90%，并增加了單抗的產(chǎn)量。Toussaint等[11]通過在rCHO中表達酵母丙酮酸羧化酶(PYC2)，改變了流加培養(yǎng)方式中葡萄糖的代謝速率，增長了細胞的對數(shù)生長期，從而增加了細胞密度及產(chǎn)量。

2.2延緩細胞凋亡

為了延長細胞培養(yǎng)的時間從而增加產(chǎn)量，有研究者建立了能表達抗凋亡基因的CHO細胞系。Majos等[12]通過在CHO 中表達1個Asp29 Asn突變的抑制凋亡基因，有效延緩了細胞凋亡。也有研究者通過敲除細胞中的促凋亡基因來延緩細胞凋亡，如Cost等[13]敲除了BCL2相關蛋白X(BAX)和BAK的基因，使單克隆抗體產(chǎn)量增加了5倍。Ritter等[14]發(fā)現(xiàn)8號染色體端粒區(qū)的缺失也可以使產(chǎn)物產(chǎn)量成倍增加。

2.3增強轉錄表達效率

有研究者在細胞信號通路研究成果的基礎上，通過表達轉錄及翻譯過程中的相關蛋白，增強轉錄和表達效率，以增加目的重組蛋白的產(chǎn)量。Le Fourn等[15]通過在CHO中表達人信號受體蛋白SRP14，成功增加了分泌表達的重組蛋白的產(chǎn)量。Peng等[16]通過表達轉錄翻譯相關蛋白SLY1、MUNC18C和XBP1，使IgG的產(chǎn)量提高了20倍；Rahimpour等[17]在CHO細胞中表達神經(jīng)酰胺轉移蛋白(CERT)的突變基因使t-PA的產(chǎn)量增加了35%。

2.4表達糖基化酶

能產(chǎn)生糖基化的重組蛋白是CHO 細胞表達系統(tǒng)重要的優(yōu)勢，研究者們通過建立能表達N-糖基化途徑中不同酶類的細胞系以增加糖基化重組蛋白的反應性。如Goh[18]建立的一個含有N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶I基因的突變體CHO-gmt4細胞系，其表達的重組葡萄糖腦苷脂酶將不需要多糖重構可直接用于治療戈謝病患者。Zhang等[19]通過CHO-gmt5細胞株表達的重組抗體,其Fc的N-多糖缺少巖藻糖和唾液酸能增強ADCC的作用。根據(jù)CHO-K1的基因組信息，Yang等[20]通過鋅指核酸酶(ZFNs)基因敲除的方法，研究了19種包括作用于N-糖基鏈分支、半乳糖基、聚LacNAc延伸、唾液酸化加蓋的N-糖基轉移酶對N-糖基化作用的影響，為更準確的表達特定糖基化方式的重組蛋白提供了重要參考。

重組CHO細胞表達重組蛋白能力的高低，不能簡單的歸結為某些關鍵基因的作用。為了得到高產(chǎn)的重組細胞株，需要研究者們綜合考慮細胞的代謝情況、培養(yǎng)條件、蛋白表達效率和蛋白加工修飾能力等諸多因素。

3　大規(guī)模培養(yǎng)研究

基因工程技術、細胞融合技術及抗體類藥物的迅速發(fā)展，推進了生物反應器培養(yǎng)技術在生物制藥中的應用。由于CHO細胞能以懸浮培養(yǎng)的方式高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)體積可達1 000 L以上，所以在大規(guī)模培養(yǎng)和重組蛋白的高產(chǎn)量生產(chǎn)中，CHO細胞表達系統(tǒng)擁有廣闊的發(fā)展前景。在大規(guī)模生產(chǎn)中，通常采用流加培養(yǎng)方式，通過添加營養(yǎng)物質(zhì)來延長培養(yǎng)時間，增加細胞密度和目的產(chǎn)品的濃度。為了更大程度的提高重組蛋白的生產(chǎn)效率，研究者們需要根據(jù)不同細胞株的生長代謝特點，選擇和優(yōu)化起始培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基及補料策略?，F(xiàn)代計算機技術、數(shù)學算法及理論的應用，也為研究者對細胞流加培養(yǎng)的優(yōu)化提供了很大幫助。

3.1優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)

選擇合適的培養(yǎng)基、優(yōu)化細胞培養(yǎng)的參數(shù)(如溫度、pH、溶氧、CO2濃度、滲透壓等)對生產(chǎn)至關重要。同時，流加工藝參數(shù)(如流加培養(yǎng)基成分、流加時間等)均需根據(jù)不同的細胞株及反應器的特點來設計優(yōu)化。Fan等[21]采用分批補料方式培養(yǎng)CHO細胞，實驗顯示培養(yǎng)基中的氨基酸和葡萄糖濃度對細胞的生長、IgG濃度和N-糖基化生成都很重要。Kim等[22]使用分批補料培養(yǎng)使IgG的產(chǎn)量達到2.3 g/L。通過用小麥蛋白水解物(WGH)代替補料中的谷氨酰胺可以使t-PA的產(chǎn)量達到422 mg/L[23]。

3.2應用新的培養(yǎng)技術

微載體培養(yǎng)是一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術。培養(yǎng)液中大量的微載體為細胞提供了極大的附著表面，從而可實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。胡顯文等[24]在攪拌式反應器中無血清培養(yǎng)分泌u-PA的DNA 重組CHO 細胞，通過部分更換Cytopore多孔微載體，解決了大規(guī)模細胞培養(yǎng)中細胞凋亡的問題。并使用周期變壓刺激技術使u-PA的產(chǎn)量提高了10倍，且可以降低葡萄糖厭氧代謝產(chǎn)生乳酸的轉化率。Ventini等[25]通過Cytodex微載體培養(yǎng)CHO-hTSH細胞的實驗表明，培養(yǎng)基中微載體的數(shù)量及在rhTSH合成期開始時的細胞濃度是提高目的蛋白產(chǎn)量的重要參數(shù)。李智等[26]利用CHO細胞能在培養(yǎng)過程中自然結團的特性，采用超聲沉降柱二合一灌流系統(tǒng)促進細胞結團和加強截留的特性，用無血清培養(yǎng)基連續(xù)灌流培養(yǎng)基因重組CHO細胞MK3-A2株，分泌表達的rhTNK-tPA生產(chǎn)率平均為89 mg/L·d。

3.3添加保護劑

聚醚F68可以有效減少生物反應器中攪拌對細胞產(chǎn)生的機械損傷。針對F68對某些細胞株的生長及產(chǎn)量降低的情況，研究者發(fā)現(xiàn)0.05%或0.075%的500 kDa的γPGA可以替代F68應用于CHO DG44細胞的培養(yǎng)中[27]。

在細胞培養(yǎng)工藝逐級放大的過程中，每一步都需要研究者們監(jiān)控細胞在生長和表達方面的相關指標。生物反應器在線監(jiān)控pH、溶氧等參數(shù)的功能、色譜和在線蛋白分解監(jiān)測等技術為大規(guī)模培養(yǎng)的過程控制提供了幫助。

4　展望

CHO細胞是表達外源蛋白最多也是最成功的一類細胞，有其不可比擬的優(yōu)點，同時也存在現(xiàn)行技術手段不能彌補的不足之處。結合生物信息學、細胞生物學、基因工程技術和生物反應器技術的研究成果，研究者們可以通過綜合考慮細胞代謝特性、蛋白表達特性等影響因素，通過研發(fā)個性化培養(yǎng)條件及培養(yǎng)工藝，構建高表達載體，篩選穩(wěn)定高產(chǎn)的重組細胞株，改造宿主細胞等角度繼續(xù)優(yōu)化CHO細胞表達系統(tǒng)，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白提供基礎。

用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重組CHO細胞，需要具備生長特性良好、能在無血清培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)、表達重組蛋白能力強、能正確的進行翻譯后修飾等特點。糖基化是蛋白翻譯后最重要的修飾之一，直接影響重組蛋白的空間結構、生物活性、穩(wěn)定性、免疫原性和生物反應性等。對重組蛋白的糖基化研究一直是研發(fā)和生產(chǎn)真核重組蛋白的熱點課題。隨著基因編輯技術的發(fā)展，研究者們通過表達特定糖基化相關酶從而得到完整、準確的特定形式的糖鏈結構，為糖基化蛋白在免疫診斷、臨床治療等領域的持續(xù)發(fā)展奠定了基礎。隨著基因技術的不斷發(fā)展，對細胞代謝、信號傳導等方面研究的持續(xù)深入，構建能表達準確修飾的糖基化重組蛋白的高產(chǎn)重組CHO細胞株仍將成為研究熱點。

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Progress of CHO Expression System

ZHENG Hui-hui, JIANG Hong*

BeijingWondergenBio-medicineTechnologyCo.Ltd.,Beijing141017,China

CHO cell expression system is the preferred system for recombinant glycoprotein production. With the evolving development and applications of serum-free suspension culture technology, genetic engineering and the large-scale culture technologies, CHO cell expression system has become the most important expression or production system of biotechnology products. This system is widely used in the research and production of antibodies, recombinant proteins and vaccines. In recent years, researchers have made great efforts to improve the expression and large-scale production of recombinant proteins by using latest bioengineering technology and the development of the recombinant protein expression mechanism. This article briefly reviewed the recent development of the CHO cell expression system in three aspects: the optimization of the culture medium, construction of engineered CHO strains for high-level production and large-scale culture research, which was expected to provide reference for research and application of CHO cell expression system.

CHO cell culture; cell engineering; recombinant antigen expression

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.03

2016-02-22; 接受日期：2016-04-04

鄭惠惠，技術員，主要從事真核重組抗原研發(fā)研究。E-mail：shanjvqiuming@163.com。*通信作者：江洪，工程師，主要從事重組抗原研發(fā)研究。E-mail：jiang@wondergen.com